当前位置: 首页 > 期刊 > 《分析化学》 > 2001年第12期
编号:10939208
人尿中8_羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法.PDF
http://www.100md.com 梅素容 许国旺 吴采樱
闂傚倷鑳舵灙缂佺粯鍨剁换娑欑節閸パ勭€銈嗘尵婵數鈧碍姘ㄩ埀顒€绠嶉崕杈╂崲閹烘梻鐜婚柨鐕傛嫹8-羟基脱氧鸟苷,气相色谱,固相萃取,气相色谱P质谱,衍生化
第1页


    参见附件(145KB,4页)。

     人尿中8_羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法.PDF

    研 究 简 报

    人尿中82羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法

    梅素容1 ,2

    许国旺3 1

    吴采樱2

    1

    (中国科学院大连化学物理研究所 ,国家色谱研究分析中心 ,大连 116011)

    2

    (武汉大学化学与分子科学学院 ,武汉 430072)

    摘 要 报道了人尿中脱氧核糖核酸(DNA)氧化损伤产物 82羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法。采用固相

    萃取和衍生化前处理步骤 ,用色谱保留值及气相色谱P 质谱进行定性鉴定 ,在给定的色谱条件下 ,尿中的 82羟

    基脱氧鸟苷能与其他杂质很好地分离 ,内标法定量。方法的线性范围为 0. 2~100μg ,FID 的检测限为 4. 56

    pgP s。分析尿样的相对标准偏差小于8. 0 %。

    关键词 82羟基脱氧鸟苷 ,气相色谱 ,固相萃取 ,气相色谱P 质谱 ,衍生化

    2001201217收稿;2001205225接受

    1 引 言

    82羟基脱氧鸟苷(82hydroxydeoxyguanosine , 8OHdG) 被公认为是 DNA 氧化损伤的一种主要的标记

    物〔 1〕,其在DNA复制与修复过程中诱发 DNA 点突变〔 2 ,3〕。研究表明 ,一些癌症患者和糖尿病患者尿中

    8OHdG含量明显高于正常人〔 4 ,5〕,因此尿中的 8OHdG对评价个体癌变危险或诊断与氧自由基相关的疾

    病方面是一种很有用的标记物 ,在临床上具有很高的应用价值和推广意义。气相色谱法( GC)在分析

    DNA氧化损伤产物方面 ,不仅具有较高的灵敏度 ,而且有广泛的适应性和选择性 ,可以同时检测到多种

    DNA氧化损伤产物。但是用 GC法分析尿中8OHdG的报道很少〔 6〕。本文通过固相萃取和衍生化前处理

    步骤 ,采用 GC法分析 ,用气相色谱P 质谱法(GCP MS)进行定性鉴定 ,并较为详细地考察了微量 8OHdG的

    衍生化条件。

    2 实验部分

    2. 1 试剂与仪器

    双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide ,BSTFA)为Merck 公司产品 ,82羟基

    脱氧鸟苷为 Sigma 公司产品 ,固相萃取柱(C18P OH , 500 mg , 6 mL) 为 Chrom. Expert Com. (U. S. A. )公司

    产品 ,乙腈、甲醇为色谱纯 ,其它试剂为分析纯。1 g L 的 82羟基脱氧鸟苷储备液用甲醇配制 ,并根据需

    要用甲醇或水稀释到一定浓度。

    日本岛津 GC217A 型气相色谱仪 ,美国J W公司 DB25MS毛细管柱(24 m ×0. 25 mm i . d. ×0. 25

    μm) ,载气为高纯氢气 ,FID检测器 , 日本岛津 CR27A 数据处理机; 日本岛津 GC217AP QP25000 型气质联

    用仪 ,毛细管柱同上 ,载气为高纯氦气 ,电离方式为 EI , NIST谱库; TCL216G高速离心机(上海安宁仪器

    厂) 。

    2. 2 尿样的固相萃取

    5 mL 等份尿样在 - 20 ℃下冷冻保存 ,样品解冻后在 2000 g下离心 10 min 除去其中的固相物质 ,用

    稀盐酸调pH为7 左右 ,用 C18P OH柱进行固相萃取(SPE) ,具体步骤为(1) SPE的活化:依次用 10 mL 甲

    醇、 10 mL 水和10 mL 的磷酸二氢钾缓冲溶液(pH = 7. 5 , 缓冲液A)冲洗柱子; (2)加载尿样:5 mL 尿样 ,2. 5 mL 一定浓度的8OHdG标样和2. 5 mL 2 molP L 氯化钠溶液混合后 ,使其慢慢通过柱子; (3)清洗杂质:

    用3 mL 缓冲液A冲洗柱子 ,并离心甩干柱子; (4)洗脱样品:用3 mL 15 %甲醇P 缓冲液A洗脱 ,收集洗脱

    第29卷

    2001年12月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第12期

    1394~1397液 ,抽干。将收集到的洗脱液加入6 mL 乙腈 ,在2000 g下离心5 min ,更进一步除去蛋白质 ,然后将洗脱

    液放入旋转蒸发器 ,在39~40 ℃下真空蒸干溶液 ,用 0. 5 mL 甲醇溶解样品 ,放入衍生瓶中 ,在氮气流中

    吹干(40 ℃) 。

    2. 3 衍生化反应

    2. 3. 1 衍生瓶的处理 新的衍生瓶内表面含有活泼的硅羟基 ,因此在使用前应对其首先硅烷化。向衍

    生瓶中加入硅烷化试剂三甲基氯硅烷、六甲基二硅氨烷和乙腈溶剂共 0. 7 mL (体积比为 1∶ 3∶ 3) ,在

    100 ℃下反应30 min后洗净待用。

    2. 3. 2 样品的衍生 在1 mL 衍生瓶中加入 0. 5 mL 一定浓度的 8OHdG P 甲醇标样 ,在 40 ℃下用氮气吹

    干样品 ,加入一定量的衍生化试剂BSTFA和内标芘浓度为25 mgP L 的乙腈溶液 ,进行衍生化反应。

    2. 4 GC及 GCP MS分析条件

    色谱条件:载气的线性流速为52 cmP s ,进样量为1μ L ,分流比为 15∶ 1 ,柱温:一阶程序升温为 210 ℃

    (5 min)

    10℃ P min

    270 ℃(5 min) ,进样口温度为300 ℃,FID温度为310 ℃。GCP MS分析的升温程序同上 ,进

    样口温度为300 ℃,接口温度为260 ℃,进样量0. 8μ L ,分流比为 10∶ 1 ,质谱轰击电子能量为 70 eV ,质量

    扫描范围30~700 u。

    3 结果与讨论

    3. 1 SPE条件的优化及萃取回收率

    萃取用缓冲液的pH对8OHdG回收率的影响很大〔 7〕,当pH = 9 时 ,8OHdG不能被 C18P OH的 SPE柱

    所保留。为此考察了pH为5. 5~8. 5范围内的影响 ,结果表明最合适的pH为 7. 5。同时考察了洗脱液

    中甲醇含量的影响 ,根据洗脱曲线 ,选用 15 %甲醇P 缓冲液A 作为洗脱液 ......

您现在查看是摘要介绍页,详见PDF附件(145KB,4页)
婵″倹鐏夐幃銊ユ躬娴h法鏁ら幍瀣簚缁涘绁︾憴鍫熸閺冪姵纭堕弻銉ф箙閹存牔绗呮潪钘夊弿閺傚浄绱濋崣顖濆厴閺勵垵顫﹂幖婊呭偍瀵洘鎼告径杈╂埂閳ユ粏娴嗛惍浣测偓婵撶礉鐠囬鍋i崙璇茬潌楠炴洘娓舵稉瀣煙閻ㄥ嫧鈧粎鏁搁懘鎴犲閳ユ繃鍨ㄩ垾婊冨斧缂冩垿銆夐垾婵婎問闂傤喓鈧拷


闂勬劒绨張宥呭閸c劌甯囬崝娑崇礉缂冩垹鐝柈銊ュ瀻娣団剝浼呴崣顏冪返閻栧崬绺炬导姘喅閹存牗婀佹稉鈧€规氨袧閸掑棛娈戝▔銊ュ斀娴兼艾鎲冲ù浣筋潔閵嗭拷
濮濓拷 pdf閸忋劍鏋� 闂団偓鐟曪拷 5 缁夘垰鍨庨敍鍫濆帳鐠愯鏁為崘宀€娅ヨぐ鏇炴倵濮e繐銇夐崣顖欎簰妫板棗褰�10娑擃亞袧閸掞拷閿涘鈧拷
    婵犵數鍎戠徊钘壝洪悩璇茬婵犻潧娲ら閬嶆煕濞戝崬鏋ゆい鈺冨厴閺屾稑鈽夐崡鐐差潾闁哄鏅滃Λ鍐蓟濞戞ǚ鏋庨煫鍥ㄦ尨閸嬫挻绂掔€n亞鍔﹀銈嗗坊閸嬫捇鏌涢悩宕囥€掓俊鍙夊姇閳规垿宕堕埞鐐亙闁诲骸绠嶉崕鍗炍涘☉銏犵劦妞ゆ帒顦悘锔筋殽閻愬樊鍎旀鐐叉喘椤㈡棃宕ㄩ鐐靛搸婵犵數鍋犻幓顏嗗緤閹灐娲箣閻樺吀绗夐梺鎸庣箓閹峰宕甸崼婢棃鏁傜粵瀣妼闂佸摜鍋為幐鎶藉蓟閺囥垹骞㈤柡鍥╁Т婵′粙鏌i姀鈺佺仩缂傚秴锕獮濠囨晸閻樿尙鐤€濡炪倖鎸鹃崑鐔哥閹扮増鈷戦柛锔诲帎閻熸噴娲Χ閸ヮ煈娼熼梺鍐叉惈閹冲氦绻氶梻浣呵归張顒傜矙閹烘鍊垫い鏂垮⒔绾惧ジ鏌¢崘銊モ偓绋挎毄濠电姭鎷冮崟鍨杹閻庢鍠栭悥鐓庣暦濮椻偓婵℃瓕顦抽柛鎾村灦缁绘稓鈧稒岣块惌濠偽旈悩鍙夋喐闁轰緡鍣i、鏇㈡晜閽樺鈧稑鈹戦敍鍕粶濠⒀呮櫕缁瑦绻濋崶銊у幐婵犮垼娉涢敃銈夊汲閺囩喐鍙忛柣鐔煎亰濡偓闂佽桨绀佺粔鎾偩濠靛绀冩い顓熷灣閹寸兘姊绘担绛嬪殐闁哥姵鎹囧畷婵婄疀濞戣鲸鏅g紓鍌欑劍宀e潡鍩㈤弮鍫熺厽闁瑰鍎戞笟娑㈡煕閺傚灝鏆i柡宀嬬節瀹曟帒顫濋鐘靛幀缂傚倷鐒﹂〃鍛此囬柆宥呯劦妞ゆ帒鍠氬ḿ鎰磼椤旇偐绠婚柨婵堝仱閺佸啴宕掑鍗炴憢闂佽崵濞€缂傛艾鈻嶉敐鍥╃煋闁割煈鍠撻埀顒佸笒椤繈顢橀悩顐n潔闂備線娼уú銈吤洪妸鈺佺劦妞ゆ帒鍋嗛弨鐗堢箾婢跺娲寸€规洏鍨芥俊鍫曞炊閵娿儺浼曢柣鐔哥矌婢ф鏁Δ鍜冪稏濠㈣埖鍔栭崑锝夋煕閵夘垰顩☉鎾瑰皺缁辨帗娼忛妸褏鐣奸梺褰掝棑婵炩偓闁诡喗绮撻幐濠冨緞婢跺瞼姊炬繝鐢靛仜椤曨厽鎱ㄦィ鍐ㄦ槬闁哄稁鍘奸崹鍌炴煏婵炵偓娅嗛柛瀣ㄥ妼闇夐柨婵嗘噹閺嗙喐淇婇姘卞ⅵ婵﹥妞介、鏇㈡晲閸℃瑦顓婚梻浣虹帛閹碱偆鎹㈠┑瀣祦閻庯綆鍠栫粻锝嗙節婵犲倸顏柟鏋姂濮婃椽骞愭惔锝傛闂佸搫鐗滈崜鐔风暦閻熸壋鍫柛鏇ㄥ弾濞村嫬顪冮妶鍡楃瑐闁绘帪绠撳鎶筋敂閸喓鍘遍梺鐟版惈缁夋潙鐣甸崱娑欑厓鐟滄粓宕滃顒夋僵闁靛ň鏅滈崑鍌炴煥閻斿搫孝閻熸瑱绠撻獮鏍箹椤撶偟浠紓浣插亾濠㈣泛鈯曡ぐ鎺戠闁稿繗鍋愬▓銈夋⒑缂佹ḿ绠栭柣鈺婂灠閻g兘鏁撻悩鑼槰闂佽偐鈷堥崜姘额敊閹达附鈷戦悹鍥b偓铏亖闂佸憡鏌ㄦ鎼佸煝閹捐绠i柣鎰綑椤庢挸鈹戦悩璇у伐闁哥噥鍨堕獮鍡涘磼濮n厼缍婇幃鈺呭箵閹烘繂濡锋繝鐢靛Л閸嬫捇鏌熷▓鍨灓缁鹃箖绠栭弻鐔衡偓鐢登瑰暩閻熸粎澧楅悡锟犲蓟濞戙垹绠抽柡鍌氱氨閺嬪懎鈹戦悙鍙夊櫣闂佸府绲炬穱濠囧箻椤旇姤娅㈤梺璺ㄥ櫐閹凤拷

   闂佽娴烽弫濠氬磻婵犲洤绐楅柡鍥╁枔閳瑰秴鈹戦悩鍙夋悙婵☆偅锕㈤弻娑㈠Ψ閵忊剝鐝栭悷婊冨簻閹凤拷  闂傚倷鑳舵灙缂佺粯顨呴埢宥夊即閵忕姵鐎梺缁樺姉閸庛倝宕曞畝鍕厽闁逛即娼ф晶顔姐亜鎼搭垱瀚�  闂備浇宕垫慨鏉懨洪妶鍥e亾濮樼厧鐏︽い銏$懇楠炲鏁冮埀顒傜矆閸曨垱鐓熸俊顖濐嚙缁茶崵绱撳蹇斿  闂傚倷鑳堕幊鎾诲触鐎n剙鍨濋幖娣妼绾惧ジ鏌曟繛鐐珔闁告濞婇弻鈩冨緞鐎n亞鍔稿┑鈽嗗灲閹凤拷