人尿中8_羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法.PDF
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梅素容 许国旺 吴采樱
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参见附件(145KB，4页)。
人尿中8_羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法.PDF
研 究 简 报
人尿中82羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法
梅素容1 ,2
许国旺3 1
吴采樱2
1
(中国科学院大连化学物理研究所 ,国家色谱研究分析中心 ,大连 116011)
2
(武汉大学化学与分子科学学院 ,武汉 430072)
摘 要 报道了人尿中脱氧核糖核酸(DNA)氧化损伤产物 82羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法。采用固相
萃取和衍生化前处理步骤 ,用色谱保留值及气相色谱P 质谱进行定性鉴定 ,在给定的色谱条件下 ,尿中的 82羟
基脱氧鸟苷能与其他杂质很好地分离 ,内标法定量。方法的线性范围为 0. 2～100μg ,FID 的检测限为 4. 56
pgP s。分析尿样的相对标准偏差小于8. 0 %。
关键词 82羟基脱氧鸟苷 ,气相色谱 ,固相萃取 ,气相色谱P 质谱 ,衍生化
2001201217收稿;2001205225接受
1 引 言
82羟基脱氧鸟苷(82hydroxydeoxyguanosine , 8OHdG) 被公认为是 DNA 氧化损伤的一种主要的标记
物〔 1〕,其在DNA复制与修复过程中诱发 DNA 点突变〔 2 ,3〕。研究表明 ,一些癌症患者和糖尿病患者尿中
8OHdG含量明显高于正常人〔 4 ,5〕,因此尿中的 8OHdG对评价个体癌变危险或诊断与氧自由基相关的疾
病方面是一种很有用的标记物 ,在临床上具有很高的应用价值和推广意义。气相色谱法( GC)在分析
DNA氧化损伤产物方面 ,不仅具有较高的灵敏度 ,而且有广泛的适应性和选择性 ,可以同时检测到多种
DNA氧化损伤产物。但是用 GC法分析尿中8OHdG的报道很少〔 6〕。本文通过固相萃取和衍生化前处理
步骤 ,采用 GC法分析 ,用气相色谱P 质谱法(GCP MS)进行定性鉴定 ,并较为详细地考察了微量 8OHdG的
衍生化条件。
2 实验部分
2. 1 试剂与仪器
双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide ,BSTFA)为Merck 公司产品 ,82羟基
脱氧鸟苷为 Sigma 公司产品 ,固相萃取柱(C18P OH , 500 mg , 6 mL) 为 Chrom. Expert Com. (U. S. A. )公司
产品 ,乙腈、甲醇为色谱纯 ,其它试剂为分析纯。1 g L 的 82羟基脱氧鸟苷储备液用甲醇配制 ,并根据需
要用甲醇或水稀释到一定浓度。
日本岛津 GC217A 型气相色谱仪 ,美国J W公司 DB25MS毛细管柱(24 m ×0. 25 mm i . d. ×0. 25
μm) ,载气为高纯氢气 ,FID检测器 , 日本岛津 CR27A 数据处理机; 日本岛津 GC217AP QP25000 型气质联
用仪 ,毛细管柱同上 ,载气为高纯氦气 ,电离方式为 EI , NIST谱库; TCL216G高速离心机(上海安宁仪器
厂) 。
2. 2 尿样的固相萃取
5 mL 等份尿样在 - 20 ℃下冷冻保存 ,样品解冻后在 2000 g下离心 10 min 除去其中的固相物质 ,用
稀盐酸调pH为7 左右 ,用 C18P OH柱进行固相萃取(SPE) ,具体步骤为(1) SPE的活化:依次用 10 mL 甲
醇、 10 mL 水和10 mL 的磷酸二氢钾缓冲溶液(pH = 7. 5 , 缓冲液A)冲洗柱子; (2)加载尿样:5 mL 尿样 ,2. 5 mL 一定浓度的8OHdG标样和2. 5 mL 2 molP L 氯化钠溶液混合后 ,使其慢慢通过柱子; (3)清洗杂质:
用3 mL 缓冲液A冲洗柱子 ,并离心甩干柱子; (4)洗脱样品:用3 mL 15 %甲醇P 缓冲液A洗脱 ,收集洗脱
第29卷
2001年12月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第12期
1394～1397液 ,抽干。将收集到的洗脱液加入6 mL 乙腈 ,在2000 g下离心5 min ,更进一步除去蛋白质 ,然后将洗脱
液放入旋转蒸发器 ,在39～40 ℃下真空蒸干溶液 ,用 0. 5 mL 甲醇溶解样品 ,放入衍生瓶中 ,在氮气流中
吹干(40 ℃) 。
2. 3 衍生化反应
2. 3. 1 衍生瓶的处理 新的衍生瓶内表面含有活泼的硅羟基 ,因此在使用前应对其首先硅烷化。向衍
生瓶中加入硅烷化试剂三甲基氯硅烷、六甲基二硅氨烷和乙腈溶剂共 0. 7 mL (体积比为 1∶ 3∶ 3) ,在
100 ℃下反应30 min后洗净待用。
2. 3. 2 样品的衍生 在1 mL 衍生瓶中加入 0. 5 mL 一定浓度的 8OHdG P 甲醇标样 ,在 40 ℃下用氮气吹
干样品 ,加入一定量的衍生化试剂BSTFA和内标芘浓度为25 mgP L 的乙腈溶液 ,进行衍生化反应。
2. 4 GC及 GCP MS分析条件
色谱条件:载气的线性流速为52 cmP s ,进样量为1μ L ,分流比为 15∶ 1 ,柱温:一阶程序升温为 210 ℃
(5 min)
10℃ P min
270 ℃(5 min) ,进样口温度为300 ℃,FID温度为310 ℃。GCP MS分析的升温程序同上 ,进
样口温度为300 ℃,接口温度为260 ℃,进样量0. 8μ L ,分流比为 10∶ 1 ,质谱轰击电子能量为 70 eV ,质量
扫描范围30～700 u。
3 结果与讨论
3. 1 SPE条件的优化及萃取回收率
萃取用缓冲液的pH对8OHdG回收率的影响很大〔 7〕,当pH = 9 时 ,8OHdG不能被 C18P OH的 SPE柱
所保留。为此考察了pH为5. 5～8. 5范围内的影响 ,结果表明最合适的pH为 7. 5。同时考察了洗脱液
中甲醇含量的影响 ,根据洗脱曲线 ,选用 15 %甲醇P 缓冲液A 作为洗脱液 ......
人尿中82羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法
梅素容1 ,2
许国旺3 1
吴采樱2
1
(中国科学院大连化学物理研究所 ,国家色谱研究分析中心 ,大连 116011)
2
(武汉大学化学与分子科学学院 ,武汉 430072)
摘 要 报道了人尿中脱氧核糖核酸(DNA)氧化损伤产物 82羟基脱氧鸟苷的气相色谱分析方法。采用固相
萃取和衍生化前处理步骤 ,用色谱保留值及气相色谱P 质谱进行定性鉴定 ,在给定的色谱条件下 ,尿中的 82羟
基脱氧鸟苷能与其他杂质很好地分离 ,内标法定量。方法的线性范围为 0. 2～100μg ,FID 的检测限为 4. 56
pgP s。分析尿样的相对标准偏差小于8. 0 %。
关键词 82羟基脱氧鸟苷 ,气相色谱 ,固相萃取 ,气相色谱P 质谱 ,衍生化
2001201217收稿;2001205225接受
1 引 言
82羟基脱氧鸟苷(82hydroxydeoxyguanosine , 8OHdG) 被公认为是 DNA 氧化损伤的一种主要的标记
物〔 1〕,其在DNA复制与修复过程中诱发 DNA 点突变〔 2 ,3〕。研究表明 ,一些癌症患者和糖尿病患者尿中
8OHdG含量明显高于正常人〔 4 ,5〕,因此尿中的 8OHdG对评价个体癌变危险或诊断与氧自由基相关的疾
病方面是一种很有用的标记物 ,在临床上具有很高的应用价值和推广意义。气相色谱法( GC)在分析
DNA氧化损伤产物方面 ,不仅具有较高的灵敏度 ,而且有广泛的适应性和选择性 ,可以同时检测到多种
DNA氧化损伤产物。但是用 GC法分析尿中8OHdG的报道很少〔 6〕。本文通过固相萃取和衍生化前处理
步骤 ,采用 GC法分析 ,用气相色谱P 质谱法(GCP MS)进行定性鉴定 ,并较为详细地考察了微量 8OHdG的
衍生化条件。
2 实验部分
2. 1 试剂与仪器
双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide ,BSTFA)为Merck 公司产品 ,82羟基
脱氧鸟苷为 Sigma 公司产品 ,固相萃取柱(C18P OH , 500 mg , 6 mL) 为 Chrom. Expert Com. (U. S. A. )公司
产品 ,乙腈、甲醇为色谱纯 ,其它试剂为分析纯。1 g L 的 82羟基脱氧鸟苷储备液用甲醇配制 ,并根据需
要用甲醇或水稀释到一定浓度。
日本岛津 GC217A 型气相色谱仪 ,美国J W公司 DB25MS毛细管柱(24 m ×0. 25 mm i . d. ×0. 25
μm) ,载气为高纯氢气 ,FID检测器 , 日本岛津 CR27A 数据处理机; 日本岛津 GC217AP QP25000 型气质联
用仪 ,毛细管柱同上 ,载气为高纯氦气 ,电离方式为 EI , NIST谱库; TCL216G高速离心机(上海安宁仪器
厂) 。
2. 2 尿样的固相萃取
5 mL 等份尿样在 - 20 ℃下冷冻保存 ,样品解冻后在 2000 g下离心 10 min 除去其中的固相物质 ,用
稀盐酸调pH为7 左右 ,用 C18P OH柱进行固相萃取(SPE) ,具体步骤为(1) SPE的活化:依次用 10 mL 甲
醇、 10 mL 水和10 mL 的磷酸二氢钾缓冲溶液(pH = 7. 5 , 缓冲液A)冲洗柱子; (2)加载尿样:5 mL 尿样 ,2. 5 mL 一定浓度的8OHdG标样和2. 5 mL 2 molP L 氯化钠溶液混合后 ,使其慢慢通过柱子; (3)清洗杂质:
用3 mL 缓冲液A冲洗柱子 ,并离心甩干柱子; (4)洗脱样品:用3 mL 15 %甲醇P 缓冲液A洗脱 ,收集洗脱
第29卷
2001年12月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第12期
1394～1397液 ,抽干。将收集到的洗脱液加入6 mL 乙腈 ,在2000 g下离心5 min ,更进一步除去蛋白质 ,然后将洗脱
液放入旋转蒸发器 ,在39～40 ℃下真空蒸干溶液 ,用 0. 5 mL 甲醇溶解样品 ,放入衍生瓶中 ,在氮气流中
吹干(40 ℃) 。
2. 3 衍生化反应
2. 3. 1 衍生瓶的处理 新的衍生瓶内表面含有活泼的硅羟基 ,因此在使用前应对其首先硅烷化。向衍
生瓶中加入硅烷化试剂三甲基氯硅烷、六甲基二硅氨烷和乙腈溶剂共 0. 7 mL (体积比为 1∶ 3∶ 3) ,在
100 ℃下反应30 min后洗净待用。
2. 3. 2 样品的衍生 在1 mL 衍生瓶中加入 0. 5 mL 一定浓度的 8OHdG P 甲醇标样 ,在 40 ℃下用氮气吹
干样品 ,加入一定量的衍生化试剂BSTFA和内标芘浓度为25 mgP L 的乙腈溶液 ,进行衍生化反应。
2. 4 GC及 GCP MS分析条件
色谱条件:载气的线性流速为52 cmP s ,进样量为1μ L ,分流比为 15∶ 1 ,柱温:一阶程序升温为 210 ℃
(5 min)
10℃ P min
270 ℃(5 min) ,进样口温度为300 ℃,FID温度为310 ℃。GCP MS分析的升温程序同上 ,进
样口温度为300 ℃,接口温度为260 ℃,进样量0. 8μ L ,分流比为 10∶ 1 ,质谱轰击电子能量为 70 eV ,质量
扫描范围30～700 u。
3 结果与讨论
3. 1 SPE条件的优化及萃取回收率
萃取用缓冲液的pH对8OHdG回收率的影响很大〔 7〕,当pH = 9 时 ,8OHdG不能被 C18P OH的 SPE柱
所保留。为此考察了pH为5. 5～8. 5范围内的影响 ,结果表明最合适的pH为 7. 5。同时考察了洗脱液
中甲醇含量的影响 ,根据洗脱曲线 ,选用 15 %甲醇P 缓冲液A 作为洗脱液 ......
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