评述与进展

    芯片毛细管电泳及其在生命科学中的应用

    王 辉 林炳承3

    (中国科学院大连化学物理研究所 ,大连 116023)

    摘 要 芯片毛细管电泳(Chip2CE)技术在近几年已取得了很大的进展。本文着重介绍芯片毛细管区带电泳

    技术 ,对等电聚焦、等速电泳、自由溶液电泳及胶束电动色谱等其它芯片电泳模式也有所提及。讨论了芯片材

    料和制作技术、芯片的几何形状、样品的操作和衍生、检测及芯片毛细管电泳技术的应用 ,特别是在核酸和蛋

    白质的分离分析中的进展。

    关键词 毛细管电泳 ,芯片 ,微机械 ,核酸 ,蛋白 ,评述

    2001202210收稿;2001208206接受

    本文系国家自然科学基金资助项目(No. 20035010 ,29975030)

    1 引 言

    最近几年 ,以毛细管电泳为核心技术、以芯片为操作平台的芯片毛细管电泳技术迅速崛起 ,并成为

    微全化学分析系统(miniaturized total chemical analysis system ,μ 2TAS ,又称芯片实验室 ,Lab2 on2a2chip)的主

    流技术 ,有可能在化学分析领域引起新一轮变革。它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品

    的同时分析 ,这种快速分析的能力及分离泳道的阵列化 ,可以得到极高的单位信息量。芯片通常只消耗

    pL 级的样品 ,并且可以在线实现样品的予处理及分析全过程 ,所有这些特点使得芯片毛细管电泳在新

    一代毛细管电泳仪的研制中 ,成为一个极为活跃的热点。

    分析仪器的芯片化曾在气相色谱中有所尝试1

    ,但该芯片装置一直未能实现商业化生产 ,这种尝试

    主要的成功之处在于将微机械技术引入到分析化学领域中。90 年代初 ,开始了芯片毛细管电泳操作模

    式的研究2 ～5。目前已在芯片上进行了荧光标记的氨基酸6

    ,DNA限制性片段4 ,7 ,8

    ,PCR产物9 ,10

    ,短

    链寡核苷酸11 ,12

    及测序片段13 ,14

    等的分离分析研究。

    在半导体工业已有的微加工技术的基础上 ,通过光蚀刻或微注模技术在芯片上制作出用于进样和

    分离的微小通道 ,是现阶段电泳芯片加工的一般途径。毛细管电泳分离以电渗流为主要驱动力 ,通过电

    压切换即可实现液体流动、进样和分离 ,不需要额外的泵和阀。另一方面通过光刻技术制成的电泳通道

    为自然连接 ,使整个系统的死体积小到可以忽略5

    ,再加上芯片易于阵列化 ,潜在价格低廉等原因 ,自

    90年代初诞生以来 ,芯片毛细管电泳便得到了飞速的发展。下面将主要介绍芯片的加工技术 ,芯片中

    通道的设计和毛细管电泳技术在芯片上的应用。

    2 材料和加工技术

    玻璃是目前使用最多的芯片材料4 ,6

    ,它的成功应用主要与其所具有的良好的光学性质、研究透彻

    的表面性质及从微电子工业引入的成熟的微加工技术有关。最近 ,各种聚合物材料也引起了大家的注

    意15 ～17

    ,这主要是由于聚合物芯片易于成形 ,且制作成本相对比较低廉。另外晶体硅、陶瓷、硅橡胶等

    材料也可用于芯片毛细管电泳的制作 ,但硅的半导体性质不太适合于高电场强度的电泳18。

    玻璃材料的加工目前多采用标准的光蚀刻技术4

    ,主要包括4步:膜的沉积、光刻、蚀刻及粘接。首

    先在玻璃表面喷涂上一层金属掩膜 ,通常是 Cr Au ,在金属掩膜层上涂上一层光敏剂。然后用适当波长

    的光经模板对芯片进行曝光 ,用适当的腐蚀液除掉已曝光部分的光敏剂和金属掩膜。在此基础上对芯

    第30卷

    2002年3月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 评述与进展

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第3期

    359～364片进行化学蚀刻 ,氢氟酸是最常用的蚀刻剂 ,可以通过控制温度来调控氢氟酸对玻璃的蚀刻速率 ,用轮

    廓曲线仪监测整个蚀刻过程。微通道蚀刻完成后 ,将芯片表面剩余的光敏物质膜和掩膜除掉。钻出芯

    片通道与外界连接的缓冲液池 ,可以钻在已蚀刻的基片上或另一片空白的玻璃基片上。最后将已蚀刻

    完成的芯片和另一空白芯片键合起来 ,就可形成一个完整的芯片。通常采用加热的方法直接进行键合 ,即将玻璃或硅加热到一定温度 ,一般为五、六百度 ,使两芯片之间的表面粘接在一起 ,几小时到十小时后

    冷却。聚合物芯片的制作技术与玻璃芯片有很大的区别 ,主要包括激光烧蚀(laser ablation)

    15

    ,注模

    (injection molding)

    16

    ,硅橡胶浇铸(silicon rubber casting)

    19

    或热凸印法(hot embossing)

    20。

    3 芯片的构造

    毛细管电泳芯片狭缝的深度一般为10～40μm ,宽度为60～200μm21。在最近几年中 ,毛细管电泳

    芯片的结构设计已取得了显著的进展。最初的毛细管电泳芯片制作在表面积比较大的基片(14. 8 ×3. 9

    cm)上 ,只有一条微通道2 ,3。几年后出现了包括两条交叉通道及 4 个缓冲池(分别为样品池、废液池、阳极和阴极池)的芯片22。Jacobson等通过将分离通道制作成弯曲的蛇形来增加分离有效距离23。为

    了进一步增加分离距离 ,Manz等设计出了同步循环毛细管电泳芯片:通道为环行 ,每一边均带有一对电

    极 ,转换电极间的电压就可使分离物沿着环行通道迁移 ,从而延长分离距离24。在芯片上制作微反应

    室可以在线实现样品予处理及柱后衍生25。为了提高单位信息量 ,又产生了阵列毛细管电泳芯

    片7 ,26。带有多条分离通道的毛细管电泳芯片具有其独特的设计要求 ,通常会受到底片的大小及检测

    等限制。多通道微芯片的一个成功应用是基因分型(genotyping) ,该芯片具有 48 条平行分离通道 ,可以

    在8 min内分离2组共96个样品26。但目前使用最多的还是以单条通道为基体派生出来的包括柱前

    衍生等在内的各种芯片。

    4 样品处理和衍生

    在毛细管电泳芯片上可以在线实现进样、样品的堆积浓缩及柱前柱后衍生等操作。芯片毛细管电

    泳分离所需样品量很小 ,通常为pL 级。在芯片中主要有两种进样结构 ,一是由分离通道(两端分别与缓

    冲液池和废液池相连)和进样通道(两端分别与样品池和样品废液池相连)所形成的十字交叉结构;二是

    由连接样品池的通道和连接废液池的通道相互交错所形成的双2T结构。在芯片毛细管电泳中绝大多

    数采用电动进样 ,也有极个别采用空气进样10。电动进样又分为门进样(gated injection)和收缩进样

    (pinched sample loading)

    27。收缩进样与门进样的最大区别在于前者进样时分离通道两端也加有电压

    而不是让其浮地 ,通过不同缓冲液池的电歧视效应可以减少样品渗漏 ,从而减小谱带展宽。为了降低检

    测限 ,Jacobson等在氨基酸分析中采用堆积进样法对样品进行予浓缩27。有时样品中的主要组分可能

    会使其中的微量组分分析受到影响 ,通过区带操作可以显著减少这种影响28。区带操作可以用来改变

    分离过程中样品的迁移方向 ,以便进行片段收集和各种分析。采用停流法收集片段会导致样品的严重

    稀释 ,在芯片分析中 ,要收集的片段可以通过电动控制从分离通道进入分支通道内 ,分离出来的样品成

    分几乎被稀释了4个数量级以上22。

    自然界中大部分物质本身没有荧光 ,为进行激光诱导荧光(LIF)检测 ,通常需对它们进行荧光标记。

    标记可以在柱前完成 ,如在毛细管电泳分离之前 ,或在柱后完成 ,对已分离的物质进行标记并检测 ......