圆二色谱和紫外可见光谱研究抗体2卟啉的相互作用

    祁 超1 ,2

    李伟国1

    张玉静2

    刘立岩2

    赵大庆3 1

    1

    (中国科学院长春应用化学研究所稀土化学与物理开放实验室 ,长春130022)

    2

    (中国人民解放军军需大学生物化学教研室 ,长春 130062)

    摘 要 圆二色谱(CD)和紫外可见光谱(UV2VIS)可用来研究单克隆抗体(McAb)2卟啉之间的相互作用。卟

    啉形成McAb2卟啉复合物 ,在 Soret带区域最大吸收峰有显著红移和增色现象。在 350～450 nm区域 ,形成复

    合物时能检测诱导的 CD光谱。CD光谱遵守朗伯2比尔定律 ,显示等吸收行为。McAb2卟啉复合物的紫外可见

    吸收及诱导的 CD光谱在pH 6～11的范围内保持不变 ,说明复合物异常稳定 ,也说明 McAb2卟啉结合位点之

    间疏水相互作用是主要因素。

    关键词 圆二色谱 ,紫外可见光谱 ,单克隆抗体 , meso2四( α, α, α, α 2O2苯乙酰苯)卟啉

    2001206224收稿;2001211209接受

    本文系国家自然科学基金(29701005)和中国科学院基础局重大项目(KJ9512A12504202)资助课题

    1 引 言

    圆二色谱(CD)对溶液中蛋白质的立体结构变化高度灵敏 ,并且能检测立体化学的微小变化1。对

    称半抗原的发色团同专一抗体的非共价结合能产生诱导的 CD 带。在抗体结合位点的非对称环境中 ,非光学活性的半抗原与抗体结合能产生这种诱导光学活性。因此 ,在半抗原的发色团吸收区域会产生

    附带的科顿效应。附带的科顿效应能明显区别相似专一性之间的抗体结合位点 ,能用来检测互补决定

    区(CDR)

    2 ～6。

    我们根据文献7

    合成的 meso2四( α, α, α, α 2O2苯乙酰苯)卟啉 ,不加载体进行免疫 ,得到的抗体8

    来模

    拟加卤过氧化物酶9。该单克隆抗体对卟啉有高亲合力 ,为了较好地了解McAb2卟啉之间的相互作用 ,获得McAb2卟啉之间的结构信息是很重要的。因此 ,我们用诱导的 CD连同紫外可见光谱来研究McAb2

    卟啉形成的复合物。

    2 实验部分

    紫外可见光谱用UV2Vis 922光谱仪(Kontrin 公司)测定 ,用 1cm池。圆二色谱用JASCO J — 500C旋

    光分光仪来测定 ,用1 cm池。用磷酸缓冲溶液(PBS ,pH 7. 00)来配制 meso2四( α, α, α, α 2O2苯乙酰苯)卟

    啉储备液(1. 0 × 10

    - 6

    molP L) ,所有光谱测定都在20 ℃下进行。抗体类型为 IgG2a (电泳纯)

    8。把适当数

    量的McAb储备液加到 800μ L 卟啉储液中混匀 ,进行 McAb2卟啉复合物实验。每个实验持续大约 10

    min ,其中包括混合和测定的时间。所有卟啉测试都加一个非相关 McAb (2 ,42二硝基氟苯诱导的) 。所

    有UV和 CD光谱都做双份。

    3 结果和讨论

    311 UV 2VIS研究

    结果如图1所示。如图中所示 ,形成抗体2卟啉复合物 ,伴随有 UV 光谱变化。在 Soret 带区域变化

    最显著 ,最大吸收发生红移和增色效应 ,曲线 b 比曲线 a 红移 8 nm ,从曲线 a 408 nm红移到曲线 b 416

    nm。红移和增色效应可能反映了苯乙酰苯基与抗体刚性且紧密的结合 ,因此扩展了发色团。

    312 诱导的 CD

    结果如图2所示。光谱遵守朗伯2比尔定律 ,显示等吸收行为。这表明光谱变化不是从聚集现象产

    生的10。使用大过量的非相关McAb(2 ,42二硝基氟苯诱导的)作对照实验 ,在这区域并未显示出可测的

    第30卷

    2002年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    601～604CD光谱。从这些数据得到的唯一结论就是看到的诱导 CD 信号反应了专一性结合现象。游离卟啉或

    McAb在 Soret 区域都没显示出可测的 CD光谱。

    313 CD光谱差异

    结果见图3和图4。只有McAb1F2与抗原 meso2四( α, α, α, α 2O2苯乙酰苯)卟啉形成的复合物信号强

    图 1 meso2四(α,α,α,α 2O2苯乙酰苯)卟啉与 McAb1F2

    结合伴随的UV2VIS变化

    Fig. 1 Ultraviolet2visible (UV2VIS) changes accompanying

    binding of meso2tetra (α,α,α,α 2O2phenylacetyl benzene)

    porphyrin(pH 7. 00 phosphate buffer solution , 20℃)

    a. meso2四(α,α,α,α 2O2苯乙酰苯) 卟啉( meso2tetra (α,α,α,α 2O2

    phenylacetyl benzene) porphyrin) (1. 0× 10 - 6

    molP L) ;b.在McAb1F2

    (2. 50× 10 - 6

    molP L)存在下,在同一条件下的 meso2四(α, α, α, α 2

    O2苯乙酰苯) 卟啉 (monoclonal antibody (McAb) ( 2. 50 ×10 - 6

    molP L)2meso2tetra (α,α,α,α 2O2 phenylacetyl benzene) porphyrin (1. 0

    × 10 - 6

    molP L) ) 。

    图 2 meso2四(α,α,α,α 2O2苯乙酰苯)卟啉与 McAb1F2

    的诱导的 CD光谱

    Fig. 2 Induced circular diochoism (CD) spectra of meso2

    tetra(α,α,α,α 2O2phenylacetyl benzene) porphyrin and McAb

    1F2

    McAb1F2∶卟啉(porphyrin) :a1 0 ;b1 0. 5 ;c1 2 ;d1 3 ;e1 4 ;f1 5 ......