反胶束萃取分离生物分子及相关领域的研究进展

    段金友 方积年3

    (中国科学院上海药物研究所 ,上海 200031)

    摘 要 综述了反胶束有关的概念、理论;反胶束萃取蛋白质的传质机制、选择性分离过程及工艺流程;反胶

    束对氨基酸、抗生素及核酸的萃取分离;反胶束与其他方法、技术相结合的应用状况。

    关键词 反胶束 ,萃取 ,分离 ,评述

    2001202223收稿;2001206211接受

    1 引 言

    传统的液2液萃取分离技术成本低 ,易于运作 ,已广泛用于多组分物质的分离。但是 ,由于缺乏相应

    的生化溶剂 ,采用该技术难以分离蛋白质、核酸等大分子生物活性物质;液相色谱技术 ,特别是制备型色

    谱技术的应用 ,使大多数生物分子的批量分离成为可能 ,然而由于该技术本身也存在某些局限性 ,例如

    一定的固定相 ,有时会引起目标物的不可逆吸附、甚至变性等现象 ,在一定程度上限制了其在生化工程

    中的应用。近年来 ,以反胶束溶液为新的溶剂系统的萃取分离技术 ,可以选择性分离某些生物活性分

    子 ,而逐渐引起了人们的重视。

    1977年Luisi 等1

    首先发现胰凝乳蛋白酶可以溶解于含双亲物质(表面活性剂)的有机溶剂中 ,超离

    心数据显示有机相中有反胶束的存在 ,同时 ,光谱分析(紫外2可见光谱、荧光光谱、旋光光谱)表明这一

    过程未引起酶的变性;1979年Luisi 等2

    考察了蛋白质溶液的 pH值、蛋白质和双亲物质的浓度对蛋白

    质萃取率的影响及蛋白质在反胶束溶液中的光谱特性;1979 年 Menger 和 Yamada

    3

    对反胶束溶液中酶

    的性质进行了研究。随后的20多年里 ,反胶束萃取技术已广泛应用于蛋白质的分离和纯化 ,并逐渐延

    伸至其他生物分子(氨基酸、抗生素、核酸)的分离研究;近年来 ,该技术结合其他一些技术、方法的应用

    正在研究和开发 ,显示了良好的应用前景。

    2 反胶束的定义、形成条件、特征和研究方法

    反胶束( reversed micelle) 是双亲物质在非极性有机溶剂中自发聚集体 ,又称为反胶团、逆胶束

    (inverse micelle)

    4 ,5。双亲物质的这种胶团化过程的自由能变化主要来源于双亲分子之间偶极子2偶极

    子相互作用 ,除此之外 ,平动能和转动能的丢失以及氢键或金属配位键的形成等都可能参与这种胶团化

    过程6。

    通常 ,形成反胶束体系的有机溶剂为脂肪烷烃;双亲物质根据其极性头基性质的不同 ,可分为以下

    4种类型:非离子型(如脂肪醇聚氧乙烯醚 ,Brij 30) ,阳离子型(如丁二酸二222乙基己基酯磺酸钠 ,AOT) ,阴离子型(如二辛基二甲基氯化铵 ,DODMAC) ,两性离子型(如卵磷脂) ;某些双亲物质 ,如三辛基甲基氯

    化铵(TOMAC) ,卵磷脂 ,需要加入一定量的助表面活性剂(一般为 C4～C12脂肪醇)才能形成稳定的反胶

    束体系。

    在反胶束内部 ,双亲分子极性头基相互聚集形成一个“极性核” ,可以增溶水、蛋白质等极性物质 ,增

    溶了大量水的反胶束体系即为微乳液(microemulsion)

    7。水在反胶束中以两种形式存在:自由水(free

    water)和结合水(bound water) ,后者由于受到双亲分子极性头基的束缚 ,具有与主体水(普通水)不同的

    物化性质 ,如粘度增大 ,介电常数减小 ,氢键形成的空间网络结构遭到破坏等8 ,9。

    对于增溶了物质(如水 ,蛋白质等)的反胶束 ,周世琦等10

    结合反胶束系统的低界面张力效应、界面

    弯矩效应、混合熵效应 ,提出了一种热力学模型 ,并通过实验阐明了其合理性。另外 ,还有其他理想化的

    第30卷

    2002年3月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 评述与进展

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第3期

    365～371分子热力学、动力学模型可供参考11 ～13。总体来说 ,这些模型基本上都认为反胶束是单层双亲分子聚

    集的近似球体 ,并忽视胶束之间的相互作用。事实上 ,反胶束体系处于不停的运动状态 ,反胶束之间的

    碰撞频率为109

    ～1011

    次 s ,而且反胶束中的增溶物在频繁的交换14。

    反胶束溶液是透明的、稳定的热力学体系 ,很多方法可以应用于研究这种体系7。如测定反胶束大

    小的方法有小角度 X射线散射法、超离心沉降法、粘度2扩散法;测定反胶束溶液的临界胶束浓度(CMC)

    的方法有正电子湮灭法、光散射法、染料吸附法、 1

    H NMR法、介电增量法等。

    3 反胶束萃取分离生物活性物质(蛋白质、氨基酸、抗生素和核酸)

    3. 1 蛋白质

    蛋白质可以采用3种形式(注入法、液2固萃取法和液2液萃取法)增溶于反胶束溶液中。前两种方

    法主要应用于与反胶束体系中酶的催化反应有关的领域 ,而且对于疏水性较强的酶常采用液2固萃取

    法;而反胶束萃取分离蛋白质主要是以液2液萃取的形式进行的15。

    3. 1. 1 反胶束萃取蛋白质的机理 ———蛋白质增溶于反胶束溶液的传质过程 静电作用力被认为是反

    胶束萃取蛋白质的主要推动力 ,同时 ,蛋白质分子与双亲分子间的疏水性作用也是其中的一个重要因

    素 ,有时甚至成为主要因素16 ～19。

    蛋白质增溶于反胶束溶液的传质过程 ,主要存在两种观点:一种观点认为反胶束与蛋白质分子在两

    相界面直接作用 ,完成质量转移过程 ,同时伴随水和离子的增溶15 ,20 ～22;另一种观点认为 ,蛋白质分子

    首先与游离的双亲分子(未参与形成反胶束的)在两相界面结合 ,形成蛋白质2双亲物质复合物23 ～26。

    Paradakar等25

    把整个过程分为如下几个步骤:

    (1)双亲分子(S)与蛋白质分子(P)在两相界面形成蛋白质2双亲物质复合物: P + n S \P 2Sn ]

    (2)若形成 P2Sn 的双亲分子数目( n)足够多 ,即 P2Sn 疏水性较强 ,P2Sn 将从界面进入有机相 ,并存

    在下列平衡:

    P 2Sn ]水相 \P 2Sn ]有机相

    若形成 P2Sn 的双亲分子数目( n)相当有限 ,P2Sn 的疏水性不能使其溶于有机相 ,则可能会出现另

    外两种情况:P2Sn 具有一定的双亲特性 ,会引起乳化现象 ,否则会在两相界面沉淀。

    (3) P2Sn 溶于有机相后 ,与更多的双亲分子结合 ,形成增溶了蛋白质的反胶束 ,同时伴随水和离子

    的增溶过程:

    P 2Sn + N naq S \P 2RM ( Naq为反胶束中双亲分子的聚集数目)

    目前 ,对于注入法、液2固萃取法 ,普遍认为蛋白质是以第一种机制来实现增溶过程的 ,而对于液2液

    萃取法 ,大多数人认为蛋白质的增溶过程与两相界面存在游离的双亲分子有关。

    3. 1. 2 反胶束溶液对目标蛋白质的选择性分离 反胶束选择性分离目标蛋白质包括两个过程:萃取过

    程(forward extraction)和反萃取过程(backward extraction) 。萃取过程:目标蛋白质从主体溶液转移至反胶

    束溶液中的过程;反萃取过程:目标蛋白质从反胶束溶液中转移至第二水相(或以固体的形式游离出来)

    的过程。

    (1)萃取过程 多种因素影响目标蛋白质的萃取 ,如蛋白质溶液的pH值、盐的浓度和离子种类、双

    亲物质的浓度和种类、蛋白质的结构和浓度等27 ,28。通过控制这些参数 ,可以选择性分离某些蛋白质 ,如Carneiro2da2cunha 等29

    从发酵液中分离纯化了通过基因重组获得的角质酶;Regalado 等30

    从辣木根

    的粗提物中纯化了辣根过氧化酶;Krienger等31

    从橘青霉的粗提物中获得了纯的脂肪酶;Rahaman 等32

    采用AOT异辛烷反胶束体系从发酵液中分离了胞外碱性蛋白酶 ......