生物大分子液相色谱分离中色谱柱长与柱径比的优化研究

    张养军 李 翔 耿信笃3

    (西北大学现代分离科学研究所 ,西安 710069)

    摘 要 用厚度为1 cm、而直径不同的色谱饼(或饼形色谱柱)对 7 种蛋白质进行了色谱谱分离 ,得出了柱长

    与柱径比对生物大分子分离度影响不大的结论。还对柱内腔几何体积相同、而柱长P 柱径比不同的色谱柱和

    色谱饼对分离度的影响以及它们压力降作了比较 ,结果表明色谱饼可在几乎不降低分离度的前提下显著降

    低色谱系统的压力。通过对10× 50mmI. D. 色谱饼体积和质量负载量以及质量回收率的测定 ,表明色谱饼对

    生物大分子的分离已达到制备规模。

    关键词 高效液相色谱 ,制备色谱 ,色谱饼 ,生物大分子 ,计量置换保留模型 ,分离度 ,柱长与柱径比

    2001206230收稿;2001211223接受

    1 引 言

    对于生物大分子而言 ,一般认为柱长对分离度影响不大1 ,2。耿信笃等依据不同生物大分子在液相

    色谱分离时 Z 值(1 mol 溶剂化溶质吸附于溶剂化固定相时 ,从二者接触表面释放出的置换剂的量)具

    有较大的差异 ,设计和制造出1 cm厚的“饼”形色谱柱(或称色谱饼) 。用这种色谱饼对 7 种蛋白进行分

    离 ,获得了满意的结果3。特别是在用色谱饼对变性蛋白进行同时复性与纯化时 ,某些溶在 7. 0 molP L

    盐酸胍或8. 0 molP L 脲中的疏水性很强的重组人治疗蛋白在遇到流动相时便会产生沉淀 ,使色谱系统的

    压力升高 ,甚至堵塞或损毁色谱柱。这就要求高效色谱系统提供5～10倍 ,甚至更高的压力。这不仅使

    色谱仪器更加昂贵 ,还会使一些色谱填料被压碎。如果能用柱长小(例如 1 cm)而直径更大的柱子 ,做

    成“饼”形色谱柱 ,不仅可以降低柱压 ,而且可用于在进样时形成沉淀的场合。这里就提出了一个在制备

    规模上生物大分子分离中柱长P 柱径比最优化的问题。为此 ,本文拟用疏水色谱对不同的柱长P 径比与

    分离度的关系进行了研究 ,并获得了好的结果。

    2 实验部分

    2. 1 仪器

    两种型号分析型高效液相色谱仪(LC26A和LC210A ,日本岛津公司)分别包括两台泵、一台系统控制

    器、一台UV2VIS检测器。其中LC26A型色谱仪的记录仪为台式自动平衡记录仪(上海大华仪表厂) ;LC2

    10A型色谱仪的数据处理采用 CLASS 2VP 工作站。Waters Delta Prep 3000 制备色谱仪 ,包括 Waters 泵系

    统、 Waters 600E系统控制器、 Waters 2487检测仪和一台台式自动平衡记录仪(上海大华仪表厂) 。色谱

    柱(饼)皆由不锈钢制作 ,其规格为10 × 10 mm I.D. 、 10 × 50 mm I.D. 、 10 × 100 mm I.D. 、 5 ×50 mm I. D.

    和 200 × 7. 9 mm I. D. ,并以高压匀浆法装填粒度为 5 ±1 μm的疏水填料(本所合成) 。实验所用超纯水

    由Barnstead E 2Pure 净水器(美国Barnstead公司)制备。

    2. 2 试剂

    细胞色素2C(Cyt2C) 、肌红蛋白(Myo) 、核糖核酸酶 A、溶菌酶(Lys) 、 α 2糜蛋白酶( α 2Chy) 、 α 2淀粉酶( α 2

    Amy) 、胰岛素( Ins)和牛血清蛋白(BSA)均购自美国 Sigma 公司 ,并用超纯水配制成质量体积浓度为 5 ×

    10

    - 3

    gP mL 的溶液。流动相由A和B 液组成 ,其中A液:3. 0 molP L (NH4 ) 2 SO4 + 0. 05 molP L KH2 PO4 (pH =

    7. 0) ,B 液:0. 05 molP L KH2 PO4 (pH = 7. 0) 。其他试剂皆为分析纯。

    2. 3 实验方法

    将各种色谱柱(饼)装于色谱系统中 ,在每次进行色谱分离之前 ,先用 A 液平衡色谱柱(饼)约 15

    第30卷

    2002年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    544～547min ,然后在所设定的色谱条件下进行色谱分离。实验中所用的检测波长皆为280 nm。

    3 结果与讨论

    3. 1 不同规格疏水型色谱柱(饼)对7种蛋白的分离

    分别将不同规格色谱饼(10 × 10 mm I.D. 、 10 ×50 mm I. D. 和 10 ×100 mm I. D. )装于色谱系统中 ,在选定的色谱条件下 ,对 Cyt2C、 Myo、 Rnase A、 Lys、 α 2Chy、 α 2Amy 和 Ins 7 种蛋白进行了分离(如图 1 所

    示) ,尽管色谱饼的柱长P 柱径比不同 ,但对 7 种蛋白分离效果几乎相同。说明在蛋白质的色谱分离中 ,当色谱饼的厚度大于优化厚度 ,也就是满足分离度要求所需的最小柱长时4

    ,柱长P 柱径比对分离度影

    图1 不同规格的色谱饼对7种蛋白的色谱分离图

    Fig. 1 Chromatogram of seven proteins by chromatographic pie different specifications

    规格(specification) :a. 10× 10 mm I. D. ; b. 10× 50 mm I. D. ; c. 10× 100 mm I. D. , 色谱条件(chromatographic

    condition) :流速(flow rate) :a. 20 mLP min ; b. 5. 0 mLP min ; c. 9. 5 mLP min ;线性梯度(linear gradient) :a. 100 %A

    → 100 %B , 12. 5 min ; b. 100 %A →100 %B ,40 min ; c. 15 %B →80 %B , 50 min ; 80 %B →100 %B , 5 min。

    1. cytochrome2c (Cyt2C) ;2. myoglobin(Myo) ; 3. ribonuclease A(RNase A) ; 4. lysozyme (Lys) ; 5. α 2chymotrypsin

    (α 2Chy) ;6.α 2amylas (α 2Amy) ; 7. insulin( Ins) ......