金属螯合亲和色谱中固定金属与蛋白质的作用

    李 蓉 邸泽梅 陈国亮3

    (西北大学化学工程系 ,西安 710069)

    摘 要 在不同pH NaCl的磷酸缓冲体系 ,比较了牛血清蛋白(BSA) 、核糖核酸酶(RNase) 、细胞色素 C(Cyt2C)

    和溶菌酶(Lys)在 IDA裸柱和一些金属螯合柱上的保留特性 ,考察了固定金属对蛋白质保留行为的影响。指

    出蛋白质在强结合 IDA2Cu柱上的保留主要受固定金属和蛋白质间配位作用支配。在弱亲和的 IDA2Ni、 IDA2

    Co 和 IDA2Zn柱上的保留主要受静电作用控制 ,配位作用为辅。讨论了金属螯合亲和色谱中影响蛋白质和金

    属配位的主要因素:金属离子的电荷和半径、配位原子对中心离子外层 d轨道的影响 ,以及蛋白质表面配位的

    组氨酸数目、离解常数和取向。影响金属螯合配体和蛋白质静电作用的主要因素为溶液的pH和蛋白质的等

    电点pI。

    关键词 金属螯合亲和色谱 ,固定金属与蛋白质作用 ,配位作用 ,静电作用

    2001206225收稿;2001212230接受

    本文系陕西省教育委员会科学基金资助课题(JG96279)

    1 引 言

    金属螯合亲和色谱是最近二十几年发展起来的一种新的分离技术1。此法是基于蛋白质与固定金

    属的亲和作用进行分离。因此 ,研究蛋白质和金属离子的作用 ,对于提高金属螯合色谱的选择性和实现

    最佳分离十分重要。关于蛋白质在金属螯合色谱中的保留机理迄今还没有一个完满的结论 ,多数学者

    认为蛋白质在金属螯合柱上的保留是由于蛋白质和固定金属的配位作用2。但是 ,对于配位作用的大

    小与哪些因素有关 ,静电作用对蛋白质保留产生什么影响以及不同色谱条件下各种力所起的作用研究

    较少。本工作通过考察不同pH下蛋白质在裸柱和金属螯合柱上的保留特征 ,探讨了固定金属与蛋白

    质间的相互作用。

    2 实验部分

    211 仪器和试剂

    LC26A型高效液相色谱仪(日本岛津公司) ;硅胶基质金属螯合柱3

    和亚氨基二乙酸( IDA)裸柱4

    由

    本实验室合成;细胞色素 C(Cyt2C) 、溶菌酶(Lys) 、核糖核酸酶(RNase) (美国 Sigma 公司) ;牛血清蛋白

    (BSA) (上海生化试剂厂) ;其它试剂均为分析纯。水为二次蒸馏水。标准蛋白混合液用磷酸缓冲液(pH

    6. 0)配制 ,各蛋白浓度为3. 0 gP L。

    212 色谱实验

    蛋白质在裸柱和金属螯合柱上的保留行为按表1色谱条件进行。

    3 结果与讨论

    311 蛋白质与金属螯合配体间的静电作用

    为了考察不同金属螯合配体对蛋白质保留行为的影响 ,分别用pH 5. 0、 6. 0和7. 0的NaCl2磷酸缓冲

    液(PB)进行梯度洗脱 ,研究BSA、 RNase、 Cyt2C和Lys在 IDA裸柱、 IDA2Cu、 IDA2Ni、 IDA2Zn和 IDA2Co 柱上

    的保留特征 ,结果见表1。

    根据蛋白质在金属螯合柱上的保留特征 ,可以把表1的金属螯合柱分为两类:一类是与蛋白质强烈

    结合的 IDA2Cu柱。另一类是与蛋白质结合较弱的 IDA2Ni、 IDA2Zn 和 IDA2Co 柱。蛋白质在强结合的金

    属柱上表现出与弱结合柱不同的色谱特性 ,所有被实验蛋白质都不能用NaCl 的磷酸缓冲液洗脱下来 ,第30卷

    2002年5月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告

    Chinese Journal of Analytical Chemistry

    第5期

    552～555表1 在裸柱和金属螯合柱上蛋白质对BSA的相对保留值

    Table 1 Relative retention of proteins to bovine serum albumin (BSA) on bare and metal chelate column

    蛋白质

    protein

    pI

    pH

    5. 0 6. 0 7. 0

    IDA

    5. 0 6. 0 7. 0

    IDA2Cu

    5. 0 6. 0 7. 0

    IDA2Ni

    5. 0 6. 0 7. 0

    IDA2Zn

    5. 0 6. 0 7. 0

    IDA2Co

    BSA 4. 8 1. 00 1. 00 1. 00 不流出 no elution 1. 00 1. 00 1. 00 1. 00 1. 00 1. 00 1. 00 1. 00 1. 00

    RNase 9. 4 15. 7 12. 7 9. 60 不流出 no elution 11. 2 11. 9 12. 6 9. 60 10. 6 11. 1 10. 6 9. 80 9. 30

    Cyt2C 10. 6 20. 9 15. 9 13. 4 不流出 no elution 13. 4 13. 0 14. 2 12. 6 13. 0 13. 3 12. 7 12. 0 13. 0

    Lys 11. 0 18. 5 17. 6 14. 5 不流出 no elution 15. 5 17. 4 20. 3 13. 7 16. 3 17. 1 15. 3 15. 8 16. 4

    流动相(mobile phase) :A. 0. 02 molP L KH2PO4 ,B. 0. 02 molP L KH2PO4 + 0. 5 molP L NaCl ;梯度洗脱(gradient elution) :20 min B从(from) 0到

    (to) 100 %;流速(flow rate) :1 mLP min ;检测器(detector) :UV(λ= 280 nm) ;进样量( size of sample) :20μ L ;各蛋白浓度(concentration of each

    protein) 3. 0 gP L ; IDA:iminodiacetic acid ; RNase :ribonucleas ; Cyt2C: cytochrome ; Lys :lysozyme

    说明蛋白质和固定金属的结合主要是较强的配位键起作用。用纯粹组氨酸(His)和甘氨酸(Gly)的缓冲

    液蛋白质也不被洗脱 ,仅在其中加入一定量的NaCl 后蛋白质才被洗脱(表2) 。这个事实表明蛋白质和

    表2 在 IDA2Cu柱上竞争洗脱剂对蛋白质保留的影响

    Table 2 Influence of competitive eluent on protein retention on IDA 2Cu column

    竞争洗脱体系

    Competitive elution system

    tRP min

    Cyt2C RNase Lys

    1. 0. 02 molP L PB + 0. 02 molP L His(pH 6. 0)

    不流出

    no elution

    不流出

    no elution

    不流出

    no elution

    2. 0. 02 molP L PB + 0. 5 molP L NaCl + 0. 02 molP L His(pH 6. 0) 14. 10 14. 16 19. 84

    3. 0. 02 molP L PB + 0. 02 molP L Gly(pH 6. 0)

    不流出

    no elution

    不流出

    no elution

    不流出

    no elution

    4. 0. 02 molP L PB + 0. 5 molP L NaCl + 0. 02 molP L Gly(pH 6. 0) 11. 97 13. 10 18. 93

    除洗脱体系A. 0. 02 molP L phosphate buffer (PB) (pH 6. 0) ;B. 表 2 给出的洗脱体系(elution systems given in Table 2) ,其它条件同表 1

    (chromatographic conditions same as in Table 1 , except the elution system) ;His :histidine ; Gly :glycine

    金属螯合配体间除配位作用外 ,还有静电作用 ......