P19细胞体外DMSO诱导向心肌样细胞分化
DMSOinduced differentiation in vitro of P19 cells towards cardiomyocytes
LI XiuHua, ZHANG Lei, WANG HaiPing, ZHAO ChunFang, YIN Qing
Department of Histology and Embryology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
【Abstract】 AIM: To induce P19 cells to differentiate towards embryonal cardiomyocytes in vitro. METHODS: P19 cells were induced to differentiate towards cardiomyocytes in the presence of 1% dimethyl sulfoxide (DMSO). Cell morphological changes were observed under an inverted microscope. The proteins for cardiac markers GATA4, connecxin43 and α sarcomeric actin were determined by immunocytochemistry. The ultrastructure was observed under transmission electron microscope (TEM). RESULTS: On day 4 after DMSOinduced differentiation, cell aggregation formed. GATA4 expression was positive on day 6 and obviously positive on day 10 after differentiation. The positive expression was in nuclear and plasma. Connecxin43 expression was positive on day 6. The positive expression was in both plasma and membrane. On day 10 after differentiation, the positive expression was more obvious. αsarcomeric actin expression was positive on day 10 after differentiation. The positive expression was in plasma. On day 6, plasma and organelle in cells increased, tight junction and intermediate junction were found and there was apophysis in cell surface and microfilament in apophysis. On day 10, mitochondrion, rough endoplasmic reticulum, smooth endoplasmic reticulum and Golgi body were rich in cytoplasm and centriole was found. CONCLUSION: P19 cells exhibit the trend of differentiation towards cardiomyocytes in vitro in the presence of 1% DMSO, which is proved by the emergence of embryonal cardiomyocytes.
【Keywords】 P19 cell; myocardium/cytology; cell differentiation; stem cell transplantation
【摘要】 目的： 体外诱导P19细胞向胚胎心肌样细胞分化. 方法： P19细胞经复苏、传代，在体外二甲基亚砜(DMSO)诱导下向心肌细胞分化，分化细胞经HE染色及心肌标志物转录因子(GATA4), 连接蛋白43(connecxin43), α肌节型肌动蛋白(αsarcomeric actin)的免疫细胞化学染色后,在光镜、倒置显微镜下观察细胞形态学变化，透射电镜下观察细胞超微结构变化. 结果： 经DMSO诱导分化后4 d有细胞聚集体形成,6 d有部分细胞GATA4和connecxin43呈阳性表达，GATA4阳性表达位于细胞核和细胞质,connecxin43阳性表达呈斑点状分布于心肌细胞胞质内和细胞膜表面. 10 d时GATA4和connecxin43阳性表达明显增加,并有部分细胞呈αsarcomeric actin阳性，阳性表达位于细胞质. 电镜观察，未分化细胞为圆形或椭圆形,细胞间连接松散，细胞质较少，细胞器不发达；诱导后6 d，细胞间出现紧密连接和中间连接,细胞质增多，部分细胞表面出现突起，突起内可见微丝. 诱导后10 d，线粒体、粗面内质网、滑面内质网、高尔基体丰富，并有中心粒形成. 结论： P19细胞在DMSO诱导下已有向心肌分化趋向，有类似胚胎心肌细胞形成.
【关键词】 P19细胞；心肌/细胞学；细胞分化；干细胞移植
0引言
心肌梗死细胞移植疗法的临床应用受到很多限制，其中移植细胞种类的确定是主要问题. 研究工作者试图找到能替代坏死心肌的细胞. 用骨骼肌卫星细胞[1]、胚胎心肌细胞[2]或骨髓间质细胞[3]进行细胞移植已有研究,但这些细胞都不是理想的移植细胞. 用心肌干细胞移植成为目前治疗这类疾病的焦点. P19细胞是一种具有分化为心肌细胞倾向的胚胎干细胞系，将体外培养的心肌干细胞注射到心肌梗死部位或冠脉灌流移植于心肌梗死区的细胞移植治疗，可以使病损区心肌重构，并改善衰竭心脏的功能. 本研究旨在将P19细胞在体外一定条件下向心肌样细胞分化，为心肌梗死干细胞移植治疗的基础研究提供一种良好的模型细胞.
1材料和方法
1.1材料
P19细胞系来源于中国武汉细胞库;αMEM培养液(美国HYCLON公司产品)；100 mL/L胎牛血清、胰蛋白酶(sigma分装)、青链霉素、0.25 mg/L二性霉素B(sigma分装)、乙二胺四乙酸(EDTA)钠及二甲基亚砜(DMSO sigma分装)均购于北京鼎国生物技术有限公司；转录因子GATA4, α肌节型肌动蛋白(αsarcomeric actin) Abm购于武汉博士德生物技术有限公司；连接蛋白43(connecxin43)多克隆抗体由日本大分大学医学部惠赠；免疫组化即用型试剂盒购于北京中山生物技术有限公司.
1.2方法
1.2.1P19细胞复苏及培养普通生长培养液配制： αMEM培养液含100 mL/L胎牛血清、青霉素1万U/L、链霉素100 mg/L, pH 7.2～7.4. 取15 mL离心管，加入9 mL普通生长培养液，从液氮中取出冻存管立即放入37℃水浴中2 min内融化，移入离心管中，1000 r/min，离心5 min，弃上清，加10 mL培养液重悬细胞，再次离心. 弃上清，加4 mL培养液重悬细胞，将细胞移入75 cm2培养瓶中，于50 mL/L CO2, 37℃条件下孵育,1～2 d更换培养液.
1.2.2P19细胞传代及向心肌细胞分化分化培养液配制： 普通生长培养液加DMSO至终浓度为10 mL/L. 细胞传代： 细胞3～4 h开始贴壁，2～3 d铺满瓶底. 用2.5 g/L的胰酶和0.2 g/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)1∶1消化贴壁细胞，使瓶底的细胞脱落并分散成单细胞，然后分瓶传代. 分化过程(以分化前为0 d,开始诱导为分化第1日，以后以此类推)： 1 d，取复苏后传5代贴壁生长的P19细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次，同上消化后以1×109个/L的密度接种于10 cm的细菌培养皿中，培养皿底部铺有一薄层5 g/L琼脂，悬浮培养于9 mL分化培养液中，进行诱导分化. 2 d，加入7 mL普通培养液. 3 d，用7 mL普通培养液置换出等量培养皿中的培养液. 4 d，有细胞聚集体(胚胎样小体)形成. 用吸管吸取4 d的胚胎样小体，用2.5 g/L的胰酶和0.2 g/L的EDTA 1∶1消化细胞，使细胞团分散成单细胞，再以1×108个/L的密度接种于明胶覆盖的25 cm2培养瓶中及放入明胶覆盖的盖玻片的6 cm培养皿中分化培养，使其贴壁生长. 每2 d换普通培养液1次. 倒置显微镜观察细胞生长情况和形态变化.
1.2.3HE染色及免疫细胞化学染色取0, 6和10 d的细胞爬片，37℃ PBS洗3次，每次1 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min，常规HE染色. 取0, 6和10 d的细胞爬片，观察各时间点GATA4, αsarcomeric actin及connecxin43的表达. 免疫组化染色步骤参照高峰等[4]方法并有所改进，细胞爬片用40 g/L多聚甲醛固定30～60 min. 10 mL/L Tritonx100 4℃过夜. 30 mL/L甲醇过氧化氢室温孵育15 min. 100 mL/L山羊血清室温孵育10 min. 加入一抗，室温孵育48 h. 加1∶300稀释生物素标记的二抗，室温孵育2 h. 加1∶300稀释链霉卵白素标记的三抗，室温孵育1 h. 以上各步骤之间用PBS洗3次，每次5 min. DAB显色，苏木精复染，常规脱水封片.
1.2.4透射电子显微镜观察取0, 6和10 d的细胞，同上述方法消化后离心，4000 r/min，5 min，使细胞成团块，PBS洗2次，40 g/L戊二醛固定2 d以上，10 g/L亚铁氰化钾∶20 g/L锇酸固定1.5 h，乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂Epon812包埋，50～60 nm超薄切片，醋酸双氧铀柠檬酸铅双染，HE7500透射电镜观察.
2结果
2.1倒置显微镜观察复苏后未分化的细胞大小均匀、分散，胞体小，呈圆形，3～4 h开始有细胞贴壁，24 h长满瓶底的50%左右，48 h细胞生长密集. DMSO诱导4 d，细胞聚集体(图1)形成. 诱导4 d后，使细胞贴壁生长，以分散、克隆集落方式增殖，随分化时间延长，细胞形态多样化，梭形细胞增多.
2.2HE染色及免疫细胞化学染色HE染色示分化前细胞(图2A)多为圆形，胞质少；分化后细胞(图2B)形态多样，胞质增多，细胞互相连接. GATA4在分化前未见阳性表达，分化第6日有一部分细胞阳性表达，分化第10日(图3A)阳性表达明显增加，阳性表达位于细胞核和细胞质. Connecxin43在分化前未见阳性表达，分化第6日有一部分细胞阳性表达，分化第10日(图3B)阳性表达明显增加，阳性表达为棕黄色颗粒，呈斑点状分布于心肌细胞胞质内和细胞膜表面. αsarcomeric actin在分化前及分化第6日未见阳性表达，分化第10日(图3C)可见阳性表达，阳性表达位于细胞质.A： 诱导分化前P19细胞； B： 诱导分化10 d P19细胞.
3讨论
干细胞是一种具有自我复制和分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞. 胚胎干细胞是一种具有无限增殖能力和全向分化能力的干细胞，在适当条件下可被诱导分化为心肌细胞，但培养条件要求极高，不适合用于移植. 成体干细胞增殖能力差，不易获得大量移植细胞.
P19细胞是从C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中分离得到，是一种能够在体外培养的胚胎干细胞，增殖能力强，如果在体外诱导向心肌分化后进行移植，可能成为较理想的替代坏死心肌的细胞. 目前国外学者在P19细胞心肌分化方面做了一些研究，Sakai等[5]用P19细胞研究探讨了心肌分化的条件和心脏发育的基因调控机制；van der Heyden等[6]将P19细胞经过多次传代建立P19CL6细胞系，并将其体外DMSO诱导向心肌细胞分化. DMSO诱导P19细胞分化是通过细胞内的钙离子短暂增加，钙离子从细胞内储存池中释放，激活对心肌分化有利的信号通路实现的[7].
心肌标志物心肌特异性转录因子GATA4具有调节心肌发生、分化的作用，Connecxin43 是细胞间进行物质和信息交流所需的一种存在于缝隙连接处的蛋白，αsarcomeric actin是一种分布于肌节Z线处的细胞骨架蛋白. P19细胞在DMSO 诱导下，这些标志物表达阳性，说明有心肌样细胞形成. 超微结构变化显示细胞出现紧密连接和中间连接,并有中心粒形成,进一步表明细胞向心肌方向分化. 我们的研究结果表明P19细胞在体外经DMSO诱导下已有向心肌分化趋向，有类似胚胎心肌细胞形成. 因此，P19细胞可以作为心肌梗死干细胞移植研究的模型细胞.
【参考文献】
[1] Menasche P, Hagege AA, Viquin JT, et al. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction [J]. J Am Coll Cardiol, 2003,41:1078-1083.
[2] Fujii T, Yau TM, Weisel RD, et al. Cell transplangtation to prevent heart failur: A comparison of cell types [J]. Ann Thorac Surg, 2003,76(6):2062-2070.
[3] Saito T, Kuang JQ, Lin CC, et al. Transcoronary implantation of bone marrow stromal cells ameliorates cardiac function after myocardial infarction [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2003,126(1):114-123.
[4] 高峰，蔡振杰，俞世强，等. 大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外诱导分化[J]. 第四军医大学学报，2002,23(20):1888-1890.
[5] Sakai T, Liu L, Shishido Y, et al. Identification of a novel, embryonal carcinoma cellassociated molecule, nucling, that is ppregulated during cardiac muscle differentiation [J]. J Biochem (Tokyo), 2003,133(4):429-436.
[6] van der Heyden MA, van Kempen MJ, Tsuji Y, et al. P19 embryonal carcinoma cells: A suitable model system for cardiac electrophysiological differentiation at the molecular and functional level [J]. Cardiovasc Res, 2003,58(2):410-422.
[7] van der Heyden MA, Defize LH. Twenty one years of P19 cells: What an embryonal carcinoma cell line taught us about cardiomyocyte differentiation [J]. Cardiovasc Res, 2003,58(2):292-302.
通讯作者：张雷. Tel: (0311)86265608Email: zhanglei@hebmu.edu.cn
作者简介：李秀华. 副主任医师，博士生(导师张雷). Tel: (0314)2069381Email: lixiuhuachengde@126.com
(河北医科大学组织胚胎学教研室，河北 石家庄 050017)
编辑杨湘华
收稿日期：20050614, 百拇医药(李秀华，张雷，王海萍，赵春芳，尹青)
LI XiuHua, ZHANG Lei, WANG HaiPing, ZHAO ChunFang, YIN Qing
Department of Histology and Embryology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
【Abstract】 AIM: To induce P19 cells to differentiate towards embryonal cardiomyocytes in vitro. METHODS: P19 cells were induced to differentiate towards cardiomyocytes in the presence of 1% dimethyl sulfoxide (DMSO). Cell morphological changes were observed under an inverted microscope. The proteins for cardiac markers GATA4, connecxin43 and α sarcomeric actin were determined by immunocytochemistry. The ultrastructure was observed under transmission electron microscope (TEM). RESULTS: On day 4 after DMSOinduced differentiation, cell aggregation formed. GATA4 expression was positive on day 6 and obviously positive on day 10 after differentiation. The positive expression was in nuclear and plasma. Connecxin43 expression was positive on day 6. The positive expression was in both plasma and membrane. On day 10 after differentiation, the positive expression was more obvious. αsarcomeric actin expression was positive on day 10 after differentiation. The positive expression was in plasma. On day 6, plasma and organelle in cells increased, tight junction and intermediate junction were found and there was apophysis in cell surface and microfilament in apophysis. On day 10, mitochondrion, rough endoplasmic reticulum, smooth endoplasmic reticulum and Golgi body were rich in cytoplasm and centriole was found. CONCLUSION: P19 cells exhibit the trend of differentiation towards cardiomyocytes in vitro in the presence of 1% DMSO, which is proved by the emergence of embryonal cardiomyocytes.
【Keywords】 P19 cell; myocardium/cytology; cell differentiation; stem cell transplantation
【摘要】 目的： 体外诱导P19细胞向胚胎心肌样细胞分化. 方法： P19细胞经复苏、传代，在体外二甲基亚砜(DMSO)诱导下向心肌细胞分化，分化细胞经HE染色及心肌标志物转录因子(GATA4), 连接蛋白43(connecxin43), α肌节型肌动蛋白(αsarcomeric actin)的免疫细胞化学染色后,在光镜、倒置显微镜下观察细胞形态学变化，透射电镜下观察细胞超微结构变化. 结果： 经DMSO诱导分化后4 d有细胞聚集体形成,6 d有部分细胞GATA4和connecxin43呈阳性表达，GATA4阳性表达位于细胞核和细胞质,connecxin43阳性表达呈斑点状分布于心肌细胞胞质内和细胞膜表面. 10 d时GATA4和connecxin43阳性表达明显增加,并有部分细胞呈αsarcomeric actin阳性，阳性表达位于细胞质. 电镜观察，未分化细胞为圆形或椭圆形,细胞间连接松散，细胞质较少，细胞器不发达；诱导后6 d，细胞间出现紧密连接和中间连接,细胞质增多，部分细胞表面出现突起，突起内可见微丝. 诱导后10 d，线粒体、粗面内质网、滑面内质网、高尔基体丰富，并有中心粒形成. 结论： P19细胞在DMSO诱导下已有向心肌分化趋向，有类似胚胎心肌细胞形成.
【关键词】 P19细胞；心肌/细胞学；细胞分化；干细胞移植
0引言
心肌梗死细胞移植疗法的临床应用受到很多限制，其中移植细胞种类的确定是主要问题. 研究工作者试图找到能替代坏死心肌的细胞. 用骨骼肌卫星细胞[1]、胚胎心肌细胞[2]或骨髓间质细胞[3]进行细胞移植已有研究,但这些细胞都不是理想的移植细胞. 用心肌干细胞移植成为目前治疗这类疾病的焦点. P19细胞是一种具有分化为心肌细胞倾向的胚胎干细胞系，将体外培养的心肌干细胞注射到心肌梗死部位或冠脉灌流移植于心肌梗死区的细胞移植治疗，可以使病损区心肌重构，并改善衰竭心脏的功能. 本研究旨在将P19细胞在体外一定条件下向心肌样细胞分化，为心肌梗死干细胞移植治疗的基础研究提供一种良好的模型细胞.
1材料和方法
1.1材料
P19细胞系来源于中国武汉细胞库;αMEM培养液(美国HYCLON公司产品)；100 mL/L胎牛血清、胰蛋白酶(sigma分装)、青链霉素、0.25 mg/L二性霉素B(sigma分装)、乙二胺四乙酸(EDTA)钠及二甲基亚砜(DMSO sigma分装)均购于北京鼎国生物技术有限公司；转录因子GATA4, α肌节型肌动蛋白(αsarcomeric actin) Abm购于武汉博士德生物技术有限公司；连接蛋白43(connecxin43)多克隆抗体由日本大分大学医学部惠赠；免疫组化即用型试剂盒购于北京中山生物技术有限公司.
1.2方法
1.2.1P19细胞复苏及培养普通生长培养液配制： αMEM培养液含100 mL/L胎牛血清、青霉素1万U/L、链霉素100 mg/L, pH 7.2～7.4. 取15 mL离心管，加入9 mL普通生长培养液，从液氮中取出冻存管立即放入37℃水浴中2 min内融化，移入离心管中，1000 r/min，离心5 min，弃上清，加10 mL培养液重悬细胞，再次离心. 弃上清，加4 mL培养液重悬细胞，将细胞移入75 cm2培养瓶中，于50 mL/L CO2, 37℃条件下孵育,1～2 d更换培养液.
1.2.2P19细胞传代及向心肌细胞分化分化培养液配制： 普通生长培养液加DMSO至终浓度为10 mL/L. 细胞传代： 细胞3～4 h开始贴壁，2～3 d铺满瓶底. 用2.5 g/L的胰酶和0.2 g/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)1∶1消化贴壁细胞，使瓶底的细胞脱落并分散成单细胞，然后分瓶传代. 分化过程(以分化前为0 d,开始诱导为分化第1日，以后以此类推)： 1 d，取复苏后传5代贴壁生长的P19细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗1次，同上消化后以1×109个/L的密度接种于10 cm的细菌培养皿中，培养皿底部铺有一薄层5 g/L琼脂，悬浮培养于9 mL分化培养液中，进行诱导分化. 2 d，加入7 mL普通培养液. 3 d，用7 mL普通培养液置换出等量培养皿中的培养液. 4 d，有细胞聚集体(胚胎样小体)形成. 用吸管吸取4 d的胚胎样小体，用2.5 g/L的胰酶和0.2 g/L的EDTA 1∶1消化细胞，使细胞团分散成单细胞，再以1×108个/L的密度接种于明胶覆盖的25 cm2培养瓶中及放入明胶覆盖的盖玻片的6 cm培养皿中分化培养，使其贴壁生长. 每2 d换普通培养液1次. 倒置显微镜观察细胞生长情况和形态变化.
1.2.3HE染色及免疫细胞化学染色取0, 6和10 d的细胞爬片，37℃ PBS洗3次，每次1 min，40 g/L多聚甲醛固定30 min，常规HE染色. 取0, 6和10 d的细胞爬片，观察各时间点GATA4, αsarcomeric actin及connecxin43的表达. 免疫组化染色步骤参照高峰等[4]方法并有所改进，细胞爬片用40 g/L多聚甲醛固定30～60 min. 10 mL/L Tritonx100 4℃过夜. 30 mL/L甲醇过氧化氢室温孵育15 min. 100 mL/L山羊血清室温孵育10 min. 加入一抗，室温孵育48 h. 加1∶300稀释生物素标记的二抗，室温孵育2 h. 加1∶300稀释链霉卵白素标记的三抗，室温孵育1 h. 以上各步骤之间用PBS洗3次，每次5 min. DAB显色，苏木精复染，常规脱水封片.
1.2.4透射电子显微镜观察取0, 6和10 d的细胞，同上述方法消化后离心，4000 r/min，5 min，使细胞成团块，PBS洗2次，40 g/L戊二醛固定2 d以上，10 g/L亚铁氰化钾∶20 g/L锇酸固定1.5 h，乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂Epon812包埋，50～60 nm超薄切片，醋酸双氧铀柠檬酸铅双染，HE7500透射电镜观察.
2结果
2.1倒置显微镜观察复苏后未分化的细胞大小均匀、分散，胞体小，呈圆形，3～4 h开始有细胞贴壁，24 h长满瓶底的50%左右，48 h细胞生长密集. DMSO诱导4 d，细胞聚集体(图1)形成. 诱导4 d后，使细胞贴壁生长，以分散、克隆集落方式增殖，随分化时间延长，细胞形态多样化，梭形细胞增多.
2.2HE染色及免疫细胞化学染色HE染色示分化前细胞(图2A)多为圆形，胞质少；分化后细胞(图2B)形态多样，胞质增多，细胞互相连接. GATA4在分化前未见阳性表达，分化第6日有一部分细胞阳性表达，分化第10日(图3A)阳性表达明显增加，阳性表达位于细胞核和细胞质. Connecxin43在分化前未见阳性表达，分化第6日有一部分细胞阳性表达，分化第10日(图3B)阳性表达明显增加，阳性表达为棕黄色颗粒，呈斑点状分布于心肌细胞胞质内和细胞膜表面. αsarcomeric actin在分化前及分化第6日未见阳性表达，分化第10日(图3C)可见阳性表达，阳性表达位于细胞质.A： 诱导分化前P19细胞； B： 诱导分化10 d P19细胞.
3讨论
干细胞是一种具有自我复制和分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞. 胚胎干细胞是一种具有无限增殖能力和全向分化能力的干细胞，在适当条件下可被诱导分化为心肌细胞，但培养条件要求极高，不适合用于移植. 成体干细胞增殖能力差，不易获得大量移植细胞.
P19细胞是从C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中分离得到，是一种能够在体外培养的胚胎干细胞，增殖能力强，如果在体外诱导向心肌分化后进行移植，可能成为较理想的替代坏死心肌的细胞. 目前国外学者在P19细胞心肌分化方面做了一些研究，Sakai等[5]用P19细胞研究探讨了心肌分化的条件和心脏发育的基因调控机制；van der Heyden等[6]将P19细胞经过多次传代建立P19CL6细胞系，并将其体外DMSO诱导向心肌细胞分化. DMSO诱导P19细胞分化是通过细胞内的钙离子短暂增加，钙离子从细胞内储存池中释放，激活对心肌分化有利的信号通路实现的[7].
心肌标志物心肌特异性转录因子GATA4具有调节心肌发生、分化的作用，Connecxin43 是细胞间进行物质和信息交流所需的一种存在于缝隙连接处的蛋白，αsarcomeric actin是一种分布于肌节Z线处的细胞骨架蛋白. P19细胞在DMSO 诱导下，这些标志物表达阳性，说明有心肌样细胞形成. 超微结构变化显示细胞出现紧密连接和中间连接,并有中心粒形成,进一步表明细胞向心肌方向分化. 我们的研究结果表明P19细胞在体外经DMSO诱导下已有向心肌分化趋向，有类似胚胎心肌细胞形成. 因此，P19细胞可以作为心肌梗死干细胞移植研究的模型细胞.
【参考文献】
[1] Menasche P, Hagege AA, Viquin JT, et al. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction [J]. J Am Coll Cardiol, 2003,41:1078-1083.
[2] Fujii T, Yau TM, Weisel RD, et al. Cell transplangtation to prevent heart failur: A comparison of cell types [J]. Ann Thorac Surg, 2003,76(6):2062-2070.
[3] Saito T, Kuang JQ, Lin CC, et al. Transcoronary implantation of bone marrow stromal cells ameliorates cardiac function after myocardial infarction [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2003,126(1):114-123.
[4] 高峰，蔡振杰，俞世强，等. 大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外诱导分化[J]. 第四军医大学学报，2002,23(20):1888-1890.
[5] Sakai T, Liu L, Shishido Y, et al. Identification of a novel, embryonal carcinoma cellassociated molecule, nucling, that is ppregulated during cardiac muscle differentiation [J]. J Biochem (Tokyo), 2003,133(4):429-436.
[6] van der Heyden MA, van Kempen MJ, Tsuji Y, et al. P19 embryonal carcinoma cells: A suitable model system for cardiac electrophysiological differentiation at the molecular and functional level [J]. Cardiovasc Res, 2003,58(2):410-422.
[7] van der Heyden MA, Defize LH. Twenty one years of P19 cells: What an embryonal carcinoma cell line taught us about cardiomyocyte differentiation [J]. Cardiovasc Res, 2003,58(2):292-302.
通讯作者：张雷. Tel: (0311)86265608Email: zhanglei@hebmu.edu.cn
作者简介：李秀华. 副主任医师，博士生(导师张雷). Tel: (0314)2069381Email: lixiuhuachengde@126.com
(河北医科大学组织胚胎学教研室，河北 石家庄 050017)
编辑杨湘华
收稿日期：20050614, 百拇医药(李秀华，张雷，王海萍，赵春芳，尹青)