微生物学实验指导.pdf
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微生物学实验指导
黄文芳 张 松 编著
华南师范大学生命科学学院
第一部分 基础实验
实验1 培养基的配制
一、实验目的和内容
目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。
内容：1.牛肉膏蛋白陈培养基的配制。
2.高氏1 号培养基的配制。
3.马丁氏培养基的配制。
二、实验材料和用具
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L
HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号
笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。
三、操作步骤
(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，Nacl5g，琼脂 15～20g，水 1000mL，PH7.4～7.6
1.称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小
烧杯或表面皿中称量， 用热水溶解后倒入大烧杯； 也可放在称量纸上称量， 随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2.加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用
玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放
入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足
所失的水分。
3. 调 pH 检测培养基的 pH，若 pH偏酸，可滴加 lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随
时用 pH试纸检测，直至达到所需 pH范围。若偏碱，则用 lmol/L HCl 进行调节。pH的调节
通常放在加琼脂之前。应注意 pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4层纱布趁热过滤，以利培养的
观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。
5.分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以
免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过
其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。
6.加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适， 四周紧贴管壁， 不留缝隙， 才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。
要使棉塞总长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则
可用 8 层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7.包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用
绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。
8.灭菌 将上述培养基于 121.3℃湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则
应故人冰箱内暂存。
9.摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的 1/2。
10.无菌检查 将灭菌的培养基放入 37℃温箱中培养 24～48h，无菌生长即可使用，或
贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。
(二)高氏 l号培养基的配制
高氏 1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：
可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂 15～20g，水 1000mL，pH7.4～7.6。
l.称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量
冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。
再加入其他成分依次溶解。对微量成分 FeSO4·7H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4· 7H2O， 配成浓度为0.01g/mL的贮备液， 再在1000mL
培养基中加入以上贮备液 1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2.pH调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
(三)马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：
K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然 pH。
1.称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。
待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成 1%的水溶液，在 1000mL
培养液中加入以上孟加拉红溶液 3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨
培养基配制。
2.分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。
3.链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至 45
℃左右时才能加入。 可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)， 在100mL
培养基中加 1%链霉素 0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素 30μg。
四、注意事项
称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调 pH时要小心操作，避免回
调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。
五、实验报告
记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。
六、问题和思考
l.配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?
2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培
养基如何进行无菌检查?
3.试设计实验对饮料进行无菌检查。
实验2 消毒与灭菌
一、干热灭菌
(一)目的要求
1.了解干热灭菌的原理和应用范围。
2.学习干热灭菌的操作技术。
(二)基本原理
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的
蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要
高(160～170℃) ，时间要长(1～2h) ，但干热灭菌温度不能超过 180℃，否则，包器皿的
纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的电烘箱的结构如图 2-1。
图 2-1 电烘箱的外观和结构
A.外观 B.结构
1.温度计; 2.排气阀; 3.箱体; 4.控温器旋钮; 5.箱门; 6.指示灯; 7.加热开关;
8.温度控制阀; 9.控制室; 10.侧门; 11.工作室; 12. 保温室; 13.电热器;
14. 散热板; 15.搁板
(三)器材
培养皿、试管、吸管、电烘箱等。
(四)操作步骤
1.装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品(培养皿、试管，吸管等)放入电烘箱内 ......
黄文芳 张 松 编著
华南师范大学生命科学学院
第一部分 基础实验
实验1 培养基的配制
一、实验目的和内容
目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。
内容：1.牛肉膏蛋白陈培养基的配制。
2.高氏1 号培养基的配制。
3.马丁氏培养基的配制。
二、实验材料和用具
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L
HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号
笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等。
三、操作步骤
(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，Nacl5g，琼脂 15～20g，水 1000mL，PH7.4～7.6
1.称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小
烧杯或表面皿中称量， 用热水溶解后倒入大烧杯； 也可放在称量纸上称量， 随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2.加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用
玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放
入己溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足
所失的水分。
3. 调 pH 检测培养基的 pH，若 pH偏酸，可滴加 lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随
时用 pH试纸检测，直至达到所需 pH范围。若偏碱，则用 lmol/L HCl 进行调节。pH的调节
通常放在加琼脂之前。应注意 pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4层纱布趁热过滤，以利培养的
观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。
5.分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以
免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过
其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。
6.加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适， 四周紧贴管壁， 不留缝隙， 才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。
要使棉塞总长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则
可用 8 层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7.包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用
绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。
8.灭菌 将上述培养基于 121.3℃湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则
应故人冰箱内暂存。
9.摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的 1/2。
10.无菌检查 将灭菌的培养基放入 37℃温箱中培养 24～48h，无菌生长即可使用，或
贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。
(二)高氏 l号培养基的配制
高氏 1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：
可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂 15～20g，水 1000mL，pH7.4～7.6。
l.称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量
冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。
再加入其他成分依次溶解。对微量成分 FeSO4·7H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO4· 7H2O， 配成浓度为0.01g/mL的贮备液， 再在1000mL
培养基中加入以上贮备液 1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2.pH调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
(三)马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：
K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 l0g，琼脂15～20g，水1000mL，自然 pH。
1.称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。
待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成 1%的水溶液，在 1000mL
培养液中加入以上孟加拉红溶液 3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨
培养基配制。
2.分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。
3.链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至 45
℃左右时才能加入。 可先将链霉素配成1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)， 在100mL
培养基中加 1%链霉素 0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素 30μg。
四、注意事项
称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调 pH时要小心操作，避免回
调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。
五、实验报告
记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。
六、问题和思考
l.配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?
2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培
养基如何进行无菌检查?
3.试设计实验对饮料进行无菌检查。
实验2 消毒与灭菌
一、干热灭菌
(一)目的要求
1.了解干热灭菌的原理和应用范围。
2.学习干热灭菌的操作技术。
(二)基本原理
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的
蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要
高(160～170℃) ，时间要长(1～2h) ，但干热灭菌温度不能超过 180℃，否则，包器皿的
纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的电烘箱的结构如图 2-1。
图 2-1 电烘箱的外观和结构
A.外观 B.结构
1.温度计; 2.排气阀; 3.箱体; 4.控温器旋钮; 5.箱门; 6.指示灯; 7.加热开关;
8.温度控制阀; 9.控制室; 10.侧门; 11.工作室; 12. 保温室; 13.电热器;
14. 散热板; 15.搁板
(三)器材
培养皿、试管、吸管、电烘箱等。
(四)操作步骤
1.装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品(培养皿、试管，吸管等)放入电烘箱内 ......
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