收稿日期: 2004204205

    基金项目: 浙江省教育厅资助(编号: 4192G20051)

    作者简介: 冉 娜(19792) , 女, 山东肥城人, 浙江大学医

    学院硕士生, 主要从事肿瘤病理研究.

    3 通讯作者

    热疗对血管内皮细胞增殖和迁移的影响

    及其在肿瘤热疗中的意义

    冉 娜, 杨泽然, 冯振中, 李继承3

    (浙江大学医学院病理教研室, 浙江 杭州 310031)

    摘要: 目的 研究热疗对血管内皮细胞(ECV 2304)增殖和迁移的影响并探讨其对肿瘤热疗的效应。方法

    (1)体内实验: HepA 肿瘤细胞接种于N IH 小鼠足垫制备荷瘤动物模型; 荷瘤鼠肿瘤局部 43℃水浴加热 25 分钟, 于

    治疗后7、 14 天观察小鼠肿瘤体积、肿瘤转移情况。(2)体外实验: 培养HepA 肿瘤细胞和内皮细胞用43℃水浴处理

    25分钟。于不同时间点, 采用M TT 法测定HepA 肿瘤细胞和内皮细胞增殖水平; 应用体外划痕法检测内皮细胞迁

    移能力; 用光镜和电镜观察内皮细胞形态变化。结果 体内实验: 热疗后7、 14 天, 热疗组肿瘤体积明显小于对照组

    (P < 0. 01) ; 热疗组肿瘤淋巴和腹腔转移率亦明显低于对照组(P < 0. 05)。体外实验: 与对照组相比, 血管内皮细胞

    和培养HepA 肿瘤细胞热疗后增殖均受到明显抑制(P < 0. 01) , 但内皮细胞的受抑制程度强于肿瘤细胞; 热疗组内

    皮细胞迁移能力明显低于对照组(P < 0. 01) ; 形态学观察可见热疗组血管内皮细胞密度降低, 细胞表面微绒毛减少

    或消失, 并可见染色质浓缩边聚、细胞出芽和凋亡小体形成等变化。结论 热疗对血管内皮细胞增殖和迁移的抑制

    可能是其发挥抗肿瘤作用的重要机制之一。

    关键词: 高温, 诱发; 肿瘤细胞, 培养的; 肿瘤? 治疗; 内皮, 血管? 病理学; 疾病模型, 动物

    中图分类号: R454 文献标识码:A 文章编号: 100121692 (2005) 0220144204

    热疗是继手术、放疗、化疗和免疫治疗法之后第

    五种治疗恶性肿瘤的方法[ 1 ]

    , 正引起人们越来越多

    的关注。目前关于热疗在体外对瘤细胞的直接杀伤

    作用的研究已有较多报道[ 2, 3 ]

    , 但对血管影响的报道

    较少。本实验观察热疗对内皮细胞增殖、迁移和形态

    的影响, 并探讨其在肿瘤热疗中的意义, 为临床寻找

    更有效的肿瘤治疗方法提供依据。

    1 材料和方法

    1 . 1 动物 雌性N IH 小鼠24 只, 体重20～ 24g, 由

    浙江大学实验动物中心提供。

    1 . 2 主要试剂 M TT 为 F luka 产品; RPM I21640

    为 G IBCO 产品; 小牛血清为杭州四季青生物工程

    研究所产品。

    1 . 3 细胞株 HepA 腹水型肝癌肿瘤细胞株为本

    实验室保存; 人脐静脉内皮细胞系(ECV 304)购自

    中科院上海细胞生物所。

    1 . 4 体内实验分组及处理 荷瘤小鼠随机分为对

    照组和热疗组, 每组 12 只。HepA 腹水型肝癌肿瘤

    细胞株由小鼠腹腔传代后接种至小鼠右侧足垫内制

    作荷瘤动物模型。肿瘤接种后至瘤体积长约 8 mm

    ×6 mm×3 mm 开始实验。对照组肿瘤接种后按常

    规饲养, 热疗组小鼠用电热恒温水浴箱加热治疗, 将

    小鼠固定于特定的固定架上, 对肿瘤肢体水浴加热,通过小孔浸于水内, 使膝关节浸泡于水下 0. 5 cm ,在进行热疗后的不同时间点观察肿瘤接种灶的大小

    及转移等情况。用精密温度计将温度控制在(43. 0±

    0. 1)℃, 时间25 分钟。 (1)接种灶肿瘤体积测定: 用

    游标卡尺测量肿瘤直径(a)、横径(b)、厚度(c) , 按下

    列公式计算肿瘤体积, 肿瘤体积= (a×b×c)×P? 6。

    (2)肿瘤转移发生率的测定: 14 天实验结束将各组

    小鼠处死, 取其 窝淋巴结, 常规石蜡切片, HE 染

    色, 光镜观察 窝肿瘤转移率; 同时观察有无腹水等

    远处转移。

    1 . 5 体外实验细胞培养及分组 HepA 肿瘤细胞

    和 ECV 细胞培养于含 10%小牛血清RPM I21640

    培养液, 实验时分为两组, 实验组细胞 43℃水浴加

    热25 分钟; 对照组细胞不予处理。

    1 . 6 肿瘤细胞增殖能力测定 取HepA 肿瘤细胞

    调浓度至 2. 5×105

    个细胞? m l ; 分为两组处理后各

    组接种于96 孔板, 0. 2 m l? 孔, 每组设 8 个复孔。于

    37℃、 5%CO 2 培养箱培养用于增殖能力测定, 培养

    48 小时后瘤细胞中加入 5 m g? m l (pH 7. 2 PBS 配

    · 441 · Journal of Pract icalOncology Vol . 20 No . 2 2005

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.制)的M TT 10 Ll, 继续培养2 小时, 弃去上清, 每孔

    加入二甲基亚砜0. 2m l, 混均, 于Clin2 b io128c 型全

    自动酶标仪 550 nm 处测定光密度A 值, 参照波长

    690 nm , 以A 值表示瘤细胞增殖程度。

    1 . 7 内皮细胞增殖能力测定 将对数生长期的

    ECV 细胞消化成单细胞悬液, 调节浓度为 4×104

    个? m l, 分组处理后分别接种于 96 孔培养板, 0. 2

    m l? 孔, 每组设 6 个复孔。37℃、 5%CO 2 培养箱孵育

    24 小时后,M TT 法检测内皮细胞增殖程度, 测定波

    长为550 nm , 参照波长690 nm , 以A 值表示内皮细

    胞增殖程度。

    1 . 8 内皮细胞迁移能力测定 采用划伤愈复测定

    内皮细胞迁移能力[ 4 ]。将稀释的ECV 细胞接种于六

    孔板上, 每孔 2 m l, 生长至融合状态后, 用无菌 100

    Ll的枪头划痕, 造成细胞间的刮沟, 每孔划三条痕,用Hank s 液冲洗后, 分组实验处理, 每组分 3 个复

    孔, 仍以含 10%小牛血清的RPM I21640 培养液培

    养 ......