卡介苗有效成分CpG.ODN2006刺激人外周血单个核细胞表达细胞因子的研究
[摘要]目的 探讨卡介苗(BCG)细胞核有效成分CpG.ODN2006对人外周血单个核细胞(HPBMCs)细胞因子表达的作用。 方法 获取正常人HPBMCs，采用不同浓度的CpG.ODN2006体外刺激HPBMCs72h，收集上清液培养，用亲和素双抗体夹心法(ELISA)检测上清液中白细胞介素4(IL.4)和白细胞介素12(IL.12)的含量。 结果 CpG.ODN2006能诱导HPBMCs产生较高水平的IL.12，并呈剂量依赖性;但对IL.4的产生没有影响。 结论 卡介苗细胞核有效成分CpG.ODN2006能有效诱导人外周血单个核细胞产生细胞因子IL.12，为膀胱肿瘤的免疫治疗提供了实验基础。
[关键词] 卡介苗;CpG.ODN;人外周血单个核细胞(HPBMCs);白细胞介素12
Study on cytokines production of human peripheral blood mononuclear cells stimulated by CpG.ODN2006
SU Yun，ZHANG Xiao-wen，YAO Mao-yin，YANG Jian-jun，YUAN Zhang，LIU Jing，YANG Guan-tian
(Department of Urology，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Objective To investigate the efficacy of CpG-ODN2006，the effective component of BCG vaccine，on cytokines production of human peripheral blood mononuclear cells(HPBMCs).Methods Different concentra-tions of CpG-ODN2006were administered to HPBMCs cultured in vitro for72hours.The cultured supernate from the stimulated HPBMCs were harvested and the level of interleukin12(IL.12)and interleukin4(IL.4)were de-tected by ELISA.Results CpG.ODN2006could significantly stimulate HPBMCs to product IL.12，Th1-associated cytokines，the enhancement was does-dependent.But CpG-ODN2006had no obvious effect to the secretion of IL.4，the Th2-associated cytokine.Conclusion CpG.ODN2006might be an effective adjuvant to induce cellular immune response via the secreation of IL.12of HPBMCs.These results suggest that CpG.ODN2006might be used for blad-der cancer immunotherapy.
Key words:Bacillus Calmette Guérin vaccine(BCG vaccine);CpG-ODN2006;human peripheral blood mono-nuclear cells(HPBMCs);interleukin-12
膀胱内灌注卡介苗(BCG)目前被公认为是预防膀胱肿瘤术后复发和治疗部分浅表性膀胱肿瘤的最佳方法[1] ，其免疫治疗的主要原理是通过BCG与膀胱壁上皮细胞结合，激活膀胱粘膜免疫系统，活化巨噬细胞等多种淋巴细胞，诱导产生γ.干扰素(IFN.γ)、白细胞介素12(IL.12)等Th1型细胞因子，产生以细胞免疫为主的免疫应答，发挥杀瘤作用[2] 。但BCG膀胱内灌注毒副作用大，许多患者难以坚持完成整个灌注疗程，从而影响其疗效。目前国内外学者均在积极寻找能降低其毒副作用并保证其疗效的新方法[3～5] 。
细菌DNA中所含的非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)序列是其具有免疫活性的物质基础，而人工合成的具有CpG序列的寡核苷酸即CpG.ODN也具有同样免疫功能。BCG细胞核有效成分CpG.ODN2006是目前发现的最强的人特异性CpG序列[6，7] ，能诱导多种免疫细胞的活化。但CpG.ODN2006能否替代BCG用于膀胱肿瘤的治疗尚不清楚。为此，我们观察了CpG.ODN2006刺激人外周血单个核细胞(HPB-MCs)对白细胞介素4(IL.4)和IL.12表达的影响，探讨CpG.ODN2006治疗膀胱肿瘤的可行性。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
CpG.ODN2006由上海生工生物技术公司合成，非甲基化，全链硫代修饰，PAGE纯化，其序列为5′.TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT.3′，溶于生理盐水成一定浓度水溶液，-20℃保存备用。正常人新鲜外周静脉血采自南京市中心血站健康献血员。完全RPMI.1640培养液由RPMI.1640干粉(购自美国GIBCO生物公司)、HEPES(购自美国AMRESCO公司，终浓度:0.59%)和胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司产品，56℃水浴30min，终浓度:12%)配制。淋巴细胞分离液(比重:1.077)购自天津TBD生物技术发展公司;人IL.4和IL.12(p40)ELISA试剂盒为美国Genzyme公司产品，由深圳晶美生物工程公司进口分装。
1.2 CpG.ODN2006刺激HPBMCs
采用密度梯度离心法分离获得HPBMCs，台盼蓝染液法检测所分离细胞的活性，活性细胞>95%，然后计数并调整细胞浓度为2×106 ml-1 ，加入96孔平底培养板，每孔100μl;分别加入不同浓度的CpG.ODN2006，每孔100μl，终浓度分别为:0、0.2、0.6、2.0和6.0μmol·L-1 ，各设3复孔，置37℃5%CO2 培养箱孵育72h。离心、取上清，放入EP管，置-20℃低温冻存待测。
1.3 细胞培养上清IL.4、IL.12和GM.CSF的检测
IL.4和IL.12均采用亲和素.生物素双抗体夹心法(ELISA)进行检测，具体步骤如下:分别取出已包被相
应特异单克隆抗体的96孔酶标板平衡至室温，分别加 入待测样本和不同浓度的标准品(每孔100μl)，IL.4标准品浓度为:0、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1000pg·ml-1 ;IL.12标准品浓度为:0、31.25、62.5、125、250、500、和1000pg·ml-1 ，各设3复孔。封板胶纸封闭酶标板，置室温120min。洗涤液洗板4次，每次3min。每孔加100μl酶.亲和素结合物(1∶250)和生物素化抗体(1∶250)混合液，置室温60min。洗板4次后，各孔分别加入显色剂A、显色剂B各1滴，置室温避光反应20min。各孔加入终止液1滴，混匀后即刻以酶联免疫测定仪测量吸光度值(A450nm )。根据标准孔样品浓度和所测A450nm 值制作标准曲线，然后利用标准曲线计算待测样本的细胞因子的浓度。
1.4 统计学处理
实验数据采用Prism3.0统计软件进行分析，多组间比较用one way.ANOVA法分析，P<0.05认为具有统计学意义。
2 结果
2.1 CpG.ODN2006刺激HPBMCs对IL.4表达的影响
不同浓度的CpG.ODN2006均能刺激HPBMCs产生一定水平的IL.4(图1)，提示CpG.ODN2006对HPB-MCs产生Th2型细胞因子无明显的增强作用。
图1 CpG.ODN2006刺激HPBMCs表达IL.4的检测结果(略)
2.2 CpG.ODN2006刺激HPBMCs对IL.12表达的影响
检测CpG.ODN2006刺激HPBMCs后上清液中IL.12浓度，结果发现:CpG.ODN2006能有效刺激HPBMCs产生IL.12，且IL.12水平与CpG.ODN2006刺激剂量呈良好的线性关系(F=3.10，P=0.0479)(图2)。提示CpG.ODN2006对HPBMCs产生Th1型细胞因子具有明显的增强作用。
图2 CpG.ODN2006刺激HPBMCs表达IL.12的检测结果(略)
3 讨论
在我国，膀胱癌是泌尿生殖系最常见的肿瘤，膀胱癌的免疫治疗在预防肿瘤复发等方面发挥重要作用。机体抗肿瘤免疫的主要方式是细胞免疫，其中T细胞、NK细胞和巨噬细胞是最主要的效应细胞。研究发现，肿瘤局部是以Th2型细胞因子占优势状态，抗肿瘤免疫作用处于被抑制状态，肿瘤局部的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分泌IL.4等Th2型细胞因子，促使局部发生Th2的漂移，同时IL.4可诱导肿瘤组织产生IL.10，维持新的Th2型TIL细胞，形成正反馈[8] 。因此，如何促使荷瘤机体由Th2向Th1逆转，使肿瘤局部高表达IL.2、IL.12和IFN.γ等Th1型细胞因子，进而诱导T细胞、NK细胞的活化和增殖，介导细胞免疫反应，发挥其对靶细胞的杀伤作用是目前膀胱癌免疫治疗需要解决的课题。
自从1984年Tokunaga等[9] 研究发现BCG的DNA具有抗肿瘤活性后，细菌DNA的免疫调节作用被人们广泛认识和重视。Krieg等[10] 发现细菌DNA中含有的特定短核苷酸序列是DNA具有免疫活性的物质基础，这些特定短核苷酸含以CpG为基元构成的特定结构，并称之为CpG序列(CpG motif)，而人工合成的CpG.ODN也具有同样免疫学功能。
本实验以CpG.ODN2006作为卡介苗细胞核有效 成分刺激HPBMCs，观察CpG.ODN2006对人外周血单个核细胞Th1.Th2免疫应答的调节作用，结果显示，CpG.ODN2006能诱导HPBMCs分泌较高水平的Th1型细胞因子IL.12，而对HPBMCs表达Th2型细胞因子IL.4的影响很小。说明CpG.ODN2006能够介导HPBMCs产生Th1型免疫应答，而不是Th2型免疫应答，为CpG.ODN2006替代卡介苗逆转膀胱癌Th2型细胞免疫抑制状态提供实验基础。
[参考文献]
[1]ALEXANDROFF A B，JACKSON A M，O'DONNELL M A，et al.BCG immunotherapy of bladder cancer:20years on[J].Lancet，1999，353:1689.1694.
[2]LAMM D L，THOR D E，HARRIS S C，et al.Bacillus Calmette-Guerin immunotherapy of superficial bladder cancer[J].J Urol，1980，124:38.40.
[3]CHIN JL，KADHIM SA，BATISLAM E，et al.Mycobacterium cell wall:an alternative to intravesical Bacillus Calmette Guérin(BCG)therapy in orthotopic murine bladder cancer[J].J Urol，1996，156(3):1189.1193.
[4]ZLOTTA A R，VAN.VOOREN J P，DENIS O，et al.What are the immunologically active components of bacille Calmette.Guerin in therapy of superficial bladder cancer?[J].Int J Cancer，2000，87(6):844.852.
[5]LUO Y，CHEN X，O'DONNELL MA.Role of Th1and Th2cyto-kines in BCG.induced IFN.gamma production:cytokine promotion and simulation of BCG effect[J].Cytokine，2003，21(1):17.26.
[6]HARTMANN G，KRIGE AM.Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells[J].J Immu-nol，2000，164(2):944.952.
[7]TODATE A，SUDA T，KUWATA H，et al.Muramyl dipeptide-Lys stimulates the function of human dendritic cells[J].J Leukoc Biol，2001，70:723.729.
[8]YOSHIMOTOT，PAUL W E.CD4pos，NK1.1pos T cells promptly produce interleukin4in response to in vivo challenge with anti-CD3[J].J Exp Med，1994，179(4):1285.1295.
[9]TOKANAGA T，YAMANOTO H，SHIMADA S，et al.Antitumor ac-tivity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG.I.Isolation，physicochemical characterization，and antitumor activity[J].J Natl Cancer Inst，1984，72:955.962.
[10]KRIEG AM，YI A K，MATSON S，et al.CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B.cell activation[J].Nature，1995，374:546.
[作者简介] 苏昀(1964-)，男，陕西宝鸡人，副主任医师，医学硕士。
(东南大学附属中大医院泌尿外科，江苏南京 210009), http://www.100md.com(苏昀，张晓文，姚茂银，杨建军，苑章，柳靖，杨关天)
[关键词] 卡介苗;CpG.ODN;人外周血单个核细胞(HPBMCs);白细胞介素12
Study on cytokines production of human peripheral blood mononuclear cells stimulated by CpG.ODN2006
SU Yun，ZHANG Xiao-wen，YAO Mao-yin，YANG Jian-jun，YUAN Zhang，LIU Jing，YANG Guan-tian
(Department of Urology，Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing210009，China)
Abstract:Objective To investigate the efficacy of CpG-ODN2006，the effective component of BCG vaccine，on cytokines production of human peripheral blood mononuclear cells(HPBMCs).Methods Different concentra-tions of CpG-ODN2006were administered to HPBMCs cultured in vitro for72hours.The cultured supernate from the stimulated HPBMCs were harvested and the level of interleukin12(IL.12)and interleukin4(IL.4)were de-tected by ELISA.Results CpG.ODN2006could significantly stimulate HPBMCs to product IL.12，Th1-associated cytokines，the enhancement was does-dependent.But CpG-ODN2006had no obvious effect to the secretion of IL.4，the Th2-associated cytokine.Conclusion CpG.ODN2006might be an effective adjuvant to induce cellular immune response via the secreation of IL.12of HPBMCs.These results suggest that CpG.ODN2006might be used for blad-der cancer immunotherapy.
Key words:Bacillus Calmette Guérin vaccine(BCG vaccine);CpG-ODN2006;human peripheral blood mono-nuclear cells(HPBMCs);interleukin-12
膀胱内灌注卡介苗(BCG)目前被公认为是预防膀胱肿瘤术后复发和治疗部分浅表性膀胱肿瘤的最佳方法[1] ，其免疫治疗的主要原理是通过BCG与膀胱壁上皮细胞结合，激活膀胱粘膜免疫系统，活化巨噬细胞等多种淋巴细胞，诱导产生γ.干扰素(IFN.γ)、白细胞介素12(IL.12)等Th1型细胞因子，产生以细胞免疫为主的免疫应答，发挥杀瘤作用[2] 。但BCG膀胱内灌注毒副作用大，许多患者难以坚持完成整个灌注疗程，从而影响其疗效。目前国内外学者均在积极寻找能降低其毒副作用并保证其疗效的新方法[3～5] 。
细菌DNA中所含的非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)序列是其具有免疫活性的物质基础，而人工合成的具有CpG序列的寡核苷酸即CpG.ODN也具有同样免疫功能。BCG细胞核有效成分CpG.ODN2006是目前发现的最强的人特异性CpG序列[6，7] ，能诱导多种免疫细胞的活化。但CpG.ODN2006能否替代BCG用于膀胱肿瘤的治疗尚不清楚。为此，我们观察了CpG.ODN2006刺激人外周血单个核细胞(HPB-MCs)对白细胞介素4(IL.4)和IL.12表达的影响，探讨CpG.ODN2006治疗膀胱肿瘤的可行性。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
CpG.ODN2006由上海生工生物技术公司合成，非甲基化，全链硫代修饰，PAGE纯化，其序列为5′.TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT.3′，溶于生理盐水成一定浓度水溶液，-20℃保存备用。正常人新鲜外周静脉血采自南京市中心血站健康献血员。完全RPMI.1640培养液由RPMI.1640干粉(购自美国GIBCO生物公司)、HEPES(购自美国AMRESCO公司，终浓度:0.59%)和胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司产品，56℃水浴30min，终浓度:12%)配制。淋巴细胞分离液(比重:1.077)购自天津TBD生物技术发展公司;人IL.4和IL.12(p40)ELISA试剂盒为美国Genzyme公司产品，由深圳晶美生物工程公司进口分装。
1.2 CpG.ODN2006刺激HPBMCs
采用密度梯度离心法分离获得HPBMCs，台盼蓝染液法检测所分离细胞的活性，活性细胞>95%，然后计数并调整细胞浓度为2×106 ml-1 ，加入96孔平底培养板，每孔100μl;分别加入不同浓度的CpG.ODN2006，每孔100μl，终浓度分别为:0、0.2、0.6、2.0和6.0μmol·L-1 ，各设3复孔，置37℃5%CO2 培养箱孵育72h。离心、取上清，放入EP管，置-20℃低温冻存待测。
1.3 细胞培养上清IL.4、IL.12和GM.CSF的检测
IL.4和IL.12均采用亲和素.生物素双抗体夹心法(ELISA)进行检测，具体步骤如下:分别取出已包被相
应特异单克隆抗体的96孔酶标板平衡至室温，分别加 入待测样本和不同浓度的标准品(每孔100μl)，IL.4标准品浓度为:0、15.625、31.25、62.5、125、250、500和1000pg·ml-1 ;IL.12标准品浓度为:0、31.25、62.5、125、250、500、和1000pg·ml-1 ，各设3复孔。封板胶纸封闭酶标板，置室温120min。洗涤液洗板4次，每次3min。每孔加100μl酶.亲和素结合物(1∶250)和生物素化抗体(1∶250)混合液，置室温60min。洗板4次后，各孔分别加入显色剂A、显色剂B各1滴，置室温避光反应20min。各孔加入终止液1滴，混匀后即刻以酶联免疫测定仪测量吸光度值(A450nm )。根据标准孔样品浓度和所测A450nm 值制作标准曲线，然后利用标准曲线计算待测样本的细胞因子的浓度。
1.4 统计学处理
实验数据采用Prism3.0统计软件进行分析，多组间比较用one way.ANOVA法分析，P<0.05认为具有统计学意义。
2 结果
2.1 CpG.ODN2006刺激HPBMCs对IL.4表达的影响
不同浓度的CpG.ODN2006均能刺激HPBMCs产生一定水平的IL.4(图1)，提示CpG.ODN2006对HPB-MCs产生Th2型细胞因子无明显的增强作用。
图1 CpG.ODN2006刺激HPBMCs表达IL.4的检测结果(略)
2.2 CpG.ODN2006刺激HPBMCs对IL.12表达的影响
检测CpG.ODN2006刺激HPBMCs后上清液中IL.12浓度，结果发现:CpG.ODN2006能有效刺激HPBMCs产生IL.12，且IL.12水平与CpG.ODN2006刺激剂量呈良好的线性关系(F=3.10，P=0.0479)(图2)。提示CpG.ODN2006对HPBMCs产生Th1型细胞因子具有明显的增强作用。
图2 CpG.ODN2006刺激HPBMCs表达IL.12的检测结果(略)
3 讨论
在我国，膀胱癌是泌尿生殖系最常见的肿瘤，膀胱癌的免疫治疗在预防肿瘤复发等方面发挥重要作用。机体抗肿瘤免疫的主要方式是细胞免疫，其中T细胞、NK细胞和巨噬细胞是最主要的效应细胞。研究发现，肿瘤局部是以Th2型细胞因子占优势状态，抗肿瘤免疫作用处于被抑制状态，肿瘤局部的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分泌IL.4等Th2型细胞因子，促使局部发生Th2的漂移，同时IL.4可诱导肿瘤组织产生IL.10，维持新的Th2型TIL细胞，形成正反馈[8] 。因此，如何促使荷瘤机体由Th2向Th1逆转，使肿瘤局部高表达IL.2、IL.12和IFN.γ等Th1型细胞因子，进而诱导T细胞、NK细胞的活化和增殖，介导细胞免疫反应，发挥其对靶细胞的杀伤作用是目前膀胱癌免疫治疗需要解决的课题。
自从1984年Tokunaga等[9] 研究发现BCG的DNA具有抗肿瘤活性后，细菌DNA的免疫调节作用被人们广泛认识和重视。Krieg等[10] 发现细菌DNA中含有的特定短核苷酸序列是DNA具有免疫活性的物质基础，这些特定短核苷酸含以CpG为基元构成的特定结构，并称之为CpG序列(CpG motif)，而人工合成的CpG.ODN也具有同样免疫学功能。
本实验以CpG.ODN2006作为卡介苗细胞核有效 成分刺激HPBMCs，观察CpG.ODN2006对人外周血单个核细胞Th1.Th2免疫应答的调节作用，结果显示，CpG.ODN2006能诱导HPBMCs分泌较高水平的Th1型细胞因子IL.12，而对HPBMCs表达Th2型细胞因子IL.4的影响很小。说明CpG.ODN2006能够介导HPBMCs产生Th1型免疫应答，而不是Th2型免疫应答，为CpG.ODN2006替代卡介苗逆转膀胱癌Th2型细胞免疫抑制状态提供实验基础。
[参考文献]
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[3]CHIN JL，KADHIM SA，BATISLAM E，et al.Mycobacterium cell wall:an alternative to intravesical Bacillus Calmette Guérin(BCG)therapy in orthotopic murine bladder cancer[J].J Urol，1996，156(3):1189.1193.
[4]ZLOTTA A R，VAN.VOOREN J P，DENIS O，et al.What are the immunologically active components of bacille Calmette.Guerin in therapy of superficial bladder cancer?[J].Int J Cancer，2000，87(6):844.852.
[5]LUO Y，CHEN X，O'DONNELL MA.Role of Th1and Th2cyto-kines in BCG.induced IFN.gamma production:cytokine promotion and simulation of BCG effect[J].Cytokine，2003，21(1):17.26.
[6]HARTMANN G，KRIGE AM.Mechanism and function of a newly identified CpG DNA motif in human primary B cells[J].J Immu-nol，2000，164(2):944.952.
[7]TODATE A，SUDA T，KUWATA H，et al.Muramyl dipeptide-Lys stimulates the function of human dendritic cells[J].J Leukoc Biol，2001，70:723.729.
[8]YOSHIMOTOT，PAUL W E.CD4pos，NK1.1pos T cells promptly produce interleukin4in response to in vivo challenge with anti-CD3[J].J Exp Med，1994，179(4):1285.1295.
[9]TOKANAGA T，YAMANOTO H，SHIMADA S，et al.Antitumor ac-tivity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG.I.Isolation，physicochemical characterization，and antitumor activity[J].J Natl Cancer Inst，1984，72:955.962.
[10]KRIEG AM，YI A K，MATSON S，et al.CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B.cell activation[J].Nature，1995，374:546.
[作者简介] 苏昀(1964-)，男，陕西宝鸡人，副主任医师，医学硕士。
(东南大学附属中大医院泌尿外科，江苏南京 210009), http://www.100md.com(苏昀，张晓文，姚茂银，杨建军，苑章，柳靖，杨关天)