星形细胞肿瘤组织MMP2与TIMP1、TIMP2的表达
[摘要] 目的 探讨基质金属蛋白酶MMP2和金属蛋白酶抑制剂TIMP1、TIMP2在人脑星形细胞肿瘤组织中的表达及其与肿瘤临床生物学行为的关系。方法 采用免疫组织化学SP法检测52例星形细胞肿瘤组织中MMP2、TIMP1和TIMP2的表达情况。结果 MMP2、TIMP1、TIMP2在星形细胞瘤(WHO Ⅱ级)、间变性星形细胞瘤(WHO Ⅲ级)与胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)中的表达水平，差别具有统计学意义(Hc=7.966～10.353，P<0.05)。结论 MMP2、TIMP1和TIMP2在星形细胞肿瘤组织中的表达与星形细胞肿瘤的侵袭性生物学行为的演进密切相关。
[关键词] 基质金属蛋白酶；金属蛋白酶类组织抑制剂；胶质瘤；免疫组织化学
EXPRESSION OF MATRIX METALLOPROTEINASE2, TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE1 AND TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE2 IN ASTROCYTOMA
NIE WENJIE，CHI JINGHUA, JI XIANGRUI， et al
(Department of Pathology, Qingdao Wanjie Hospital, Qingdao 266101, China)
[ABSTRACT]ObjectiveTo study the expressions of matrix metalloproteinase2 (MMP2), tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) and tissue inhibitor of metalloproteinase2 (TIMP2) in astrocytoma and their relationship with the clinical biological behavior of the tumor.MethodsExpressions of MMP2, TIMP1 and TIMP2 were detected in 52 cases of astrocytoma by immunohistochemical (SP) staining method. ResultsThe differences of the expressions of MMP2, TIMP1 and TIMP2 in astrocytoma (WHO grade Ⅱ), anaplantic astrocytoma (WHO grade Ⅲ) and glioblastoma (WHO grade Ⅳ) were significant (Hc=7.966-10.353，P<0.05). ConclusionThe expression of MMP2, TIMP1 and TIMP2 are closely correlated with the development of the invasive activity of human astrocytoma.
[KEY WORDS]metalloproteinase; tissue inhibitor of metalloproteinase; glioma; immunohistochemistry
星形细胞来源的肿瘤是人中枢神经系统中最常见的肿瘤，其生物学行为呈进行性加重是重要特征之一，其侵袭性生长的演进与其分泌多种基质降解酶降解细胞外基质(ECM)中的基质成分有关[1]。基质金属蛋白酶2(MMP2)以ECM中Ⅳ、Ⅴ型胶原为主要底物，在肿瘤的侵袭中起重要作用。金属蛋白酶抑制剂(TIMP1、TIMP2)是基质金属蛋白酶的特异性抑制剂。本研究旨在通过检测MMP2、TIMP1和TIMP2在不同级别的星形细胞肿瘤中的表达，探讨其在星形细胞肿瘤临床生物学行为演进过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料来源
本实验52例不同级别星形细胞肿瘤系选自青岛大学医学院附属医院病理科1999年1月~2003年1月存档组织蜡块。按1993年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准分类：星形细胞瘤(WHO Ⅱ级)14例、间变性星形细胞瘤(WHO Ⅲ级)20例、胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)18例。其中，男36例，女22例，年龄13~78岁。另外取非肿瘤脑组织4例作为研究对照。所有病例的组织蜡块均做5 μm厚连续切片，1张苏木精伊红染色，其余3张分别备MMP2、TIMP1和TIMP2免疫组化染色。
1.2 试剂来源
购自美国Santa Cruz公司的TIMP1、MMP2、TIMP2鼠抗人单克隆抗体，北京中山生物试剂公司的SP试剂盒、DAB显色试剂盒和POLYA防脱片剂。
1.3 检测方法
采用免疫组化SP三步法。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。
1.4 结果判定
MMP2、TIMP1和TIMP2阳性染色均为细胞浆内或细胞膜上出现棕黄色颗粒。采用HPIAS100高清晰度彩色病理图像分析系统观察免疫组化结果。随机选取5个高倍镜视野，计数阳性细胞数，阳性细胞数<5%为阴性(-)；阳性细胞数5%~29%为弱阳性(+)；阳性细胞数30%~60%为中强阳性()；阳性细胞数>60%为强阳性()。
1.5 统计学处理
数据以SPSS 11.0软件处理, 组间比较采用等级秩和检验。
2 结果
2.1 MMP2、TIMP1、TIMP2在正常组织表达
正常组织或非瘤脑组织中，MMP2、TIMP1、TIMP2均有表达，阳性着色位于内皮细胞胞浆和基底膜。
2.2 MMP2、TIMP1、TIMP2在星形细胞肿瘤组织中的表达
在星形细胞肿瘤中，MMP2、TIMP1、TIMP2表达阳性着色主要见于部分瘤细胞的胞浆，也见于血管基底膜和血管内皮细胞，其中瘤巨细胞多呈强阳性表达。不同级别的星形细胞肿瘤组织，MMP2、TIMP1、TIMP2的阳性表达强度差别具有统计学意义(Hc=7.966～10.353，P<0.05)。见表1。
表1 星形细胞肿瘤组织MMP2、TIMP1、TIMP2的表达(略)
3 讨论
星形细胞源肿瘤包括了具有不同侵袭能力的一大类肿瘤。其瘤细胞的侵袭生长，必然通过基质成分的改变及破坏得以实现。而MMPs与TIMPs是维持ECM平衡关系之酶系，在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用[2]，研究MMPs和TIMPs在星形细胞肿瘤中的表达对认识和了解星形细胞肿瘤的生物学行为是必要的。
本研究结果显示，MMP2、TIMP1和TIMP2的阳性表达水平在星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤与胶质母细胞瘤之间差别均具有统计学意义。表明MMP2、TIMP1和TIMP2与星形细胞肿瘤的恶性程度有关，其在星形细胞肿瘤的演进过程中具有不可忽视的作用，与星形细胞肿瘤临床生物学行为密切相关；其表达率的不同是星形细胞肿瘤在演进过程中瘤细胞异质化的结果，也是不同侵袭能力的瘤细胞亚群形成的反映。因此，可以作为判断低度恶性和高度恶性星形细胞肿瘤的免疫学形态指标。
MMP2表达率随星形细胞肿瘤恶性程度的升高而升高，可理解为MMP2阳性表达增强使星形细胞肿瘤的侵袭性生长能力加强，在肿瘤的生物学行为的演进中扮演着重要角色。但是，在本研究中TIMP1和TIMP2的阳性表达与MMP2的阳性表达平行的检测结果，在客观上与其功能相悖。分析其原因，认为它们与MMP2间的相互作用和平衡与肿瘤的侵袭性有关。体外研究证明TIMPs具有抑制星形细胞瘤侵袭的作用，而这一作用正是通过抑制MMPs实现的[3]。TIMPs的升高可能是MMPs升高的伴随结果，目的为抑制MMPs作用，抑制肿瘤的侵袭。关于TIMP在胶质瘤中的表达有不同的研究报道。MOHANAM等[4]报道，TIMP1和TIMP2在正常脑组织和肿瘤组织中均有表达，但在高度侵袭性的胶质母细胞瘤中表达较低。低级别的中枢神经系统肿瘤比高级别的肿瘤分泌更多的TIMP，从而可以解释它们侵袭力的不同。NAKANO等[5]的研究结果却表明，TIMP1的表达与肿瘤的恶性程度呈正相关。NUTTALL等[6]研究结果表明，在胶质瘤特别是在恶性胶质瘤中MMPs和TIMPs的表达水平是同时升高的。本研究显示，TIMP1、TIMP2与MMP2在星形细胞肿瘤特别是高级别星形细胞肿瘤中是同时过度表达的，支持后二者的观点。
MMP2、TIMP1和TIMP2表达阳性的组织中并非所有瘤细胞均着色，而是仅有部分瘤细胞着色，TIMP1和TIMP2在星形细胞瘤中的阳性表达较弱，且均小于中强阳性。说明MMP2、TIMP1、TIMP2三者的表达活性存在着不平衡。TIMPs是MMPs的特异性抑制因子，能够抑制MMPs的活性和肿瘤细胞侵袭，MMP2与TIMPs比例的失衡可能是导致肿瘤侵袭的另一重要原因。
本研究结果显示，正常或非瘤脑组织和星形细胞肿瘤中MMP2、TIMP1、TIMP2在血管内皮细胞和基底膜上均有表达，提示其与肿瘤演进过程、促进肿瘤血管生成有关。新生血管的形成是从基底膜的降解开始的，最接近血管形成刺激因子的静脉基底膜降解内皮细胞伸长，形成血管芽伸入细胞外基质，最终形成新的血管和基底膜。体外研究表明，血管内皮细胞可产生MMPs和TIMPs[7]。血管基底膜上60%～80%的成分是Ⅳ型胶原，而Ⅳ型胶原正是MMP2的底物之一[8]，活化的血管内皮细胞增殖，合成MMP2降解基底膜基质，形成有利于血管细胞迁移的微环境。TIMP1、TIMP2在血管内皮细胞和基底膜上的表达显示其参与血管形成，主要通过抑制MMPs来影响血管的发生。肿瘤的生长和侵袭有赖于新生血管的形成，MMP2、TIMP1、TIMP2通过参与新生血管的形成而影响星形细胞肿瘤的侵袭性生物学行为的演进过程。
总之，MMP2、TIMP1和TIMP2在星形细胞肿瘤中的表达与星形细胞肿瘤的侵袭性生物学行为密切相关，MMP2与TIMPs之间的平衡在此过程中也起着重要的作用；MMP2、TIMP1和TIMP2参与肿瘤血管生成也是影响星形细胞肿瘤生物学行为的重要因素。
[参考文献]
[1]KLAUS L, UWE M, MRCIA R , et al. Expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in human brain tumors [J]. Am J Pathol, 1998,153:429.
[2]FORSYTH P A, WONG H, LAING T D, et al. Gelatinase A(MMP2), gelatinaseB(MMP9)and membrane type matrix metalloproteinase1(MTMMP) are involved in different aspects of the pathophysiology of malifnant gliomas[J]. Br J Cancer, 1999,79(11/12):1828.
[3]MOHANAM S, WANG S W, RAYFORD A, et al. Expression of tissue inhibitors of metalloproteinases: negative regulators of human glioblastoma invasion in vivo[J]. Clin Exp Metastasis, 1995,13(1):57.
[4]MOHANAM S, WANG W W, RAYFORD A, et al. Expression of tissue inhibitors of metalloproteinases: negative regulators of human glioblastoma invasion in vivo [J]. Clin Exp Metastasis, 1995,13:57.
[5]NAKANO A, TANI E, MIYAZAKI K, et al. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteases in human gliomas [J]. J Neurosurg, 1995,83:208.
[6]NUTTALL R K, PENNINGTON C J, TAPLIN J, et al. Elevated membranetype matrix metalloproteinases in gliomas revealed by profiling proteases and inhibitors in human cancer cells[J].Mol Cancer Res, 2003,1(5):333.
[7]HERRON G S, WERB Z, DWYER K, et al. Secretion of metalloproteinases by stimulated capillary endothelial cells.Ⅰ.Production of procollagenase and prostromelysin exceeds expression of proteolytic activity[J]. Biol Chem, 1986,261:2810.
[8]KACHRA Z, BEAULIEU E, DELBECCHI L, et al. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human brain tumors [J].Clin Exp Metastasis, 1999,17(7):555.
(本文编辑 马伟平)
[作者简介]聂文洁(1972)，女，主治医师，青岛大学医学院病理学在职研究生。
[通讯作者]纪祥瑞(1950)，男，硕士，教授，硕士生导师，电话053282911533，邮编266003。
(青岛万杰医院病理科，山东 青岛 266101；青岛大学医学院病理学教研室), 百拇医药(聂文洁，迟菁华，纪祥瑞，王良忠)
[关键词] 基质金属蛋白酶；金属蛋白酶类组织抑制剂；胶质瘤；免疫组织化学
EXPRESSION OF MATRIX METALLOPROTEINASE2, TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE1 AND TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE2 IN ASTROCYTOMA
NIE WENJIE，CHI JINGHUA, JI XIANGRUI， et al
(Department of Pathology, Qingdao Wanjie Hospital, Qingdao 266101, China)
[ABSTRACT]ObjectiveTo study the expressions of matrix metalloproteinase2 (MMP2), tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) and tissue inhibitor of metalloproteinase2 (TIMP2) in astrocytoma and their relationship with the clinical biological behavior of the tumor.MethodsExpressions of MMP2, TIMP1 and TIMP2 were detected in 52 cases of astrocytoma by immunohistochemical (SP) staining method. ResultsThe differences of the expressions of MMP2, TIMP1 and TIMP2 in astrocytoma (WHO grade Ⅱ), anaplantic astrocytoma (WHO grade Ⅲ) and glioblastoma (WHO grade Ⅳ) were significant (Hc=7.966-10.353，P<0.05). ConclusionThe expression of MMP2, TIMP1 and TIMP2 are closely correlated with the development of the invasive activity of human astrocytoma.
[KEY WORDS]metalloproteinase; tissue inhibitor of metalloproteinase; glioma; immunohistochemistry
星形细胞来源的肿瘤是人中枢神经系统中最常见的肿瘤，其生物学行为呈进行性加重是重要特征之一，其侵袭性生长的演进与其分泌多种基质降解酶降解细胞外基质(ECM)中的基质成分有关[1]。基质金属蛋白酶2(MMP2)以ECM中Ⅳ、Ⅴ型胶原为主要底物，在肿瘤的侵袭中起重要作用。金属蛋白酶抑制剂(TIMP1、TIMP2)是基质金属蛋白酶的特异性抑制剂。本研究旨在通过检测MMP2、TIMP1和TIMP2在不同级别的星形细胞肿瘤中的表达，探讨其在星形细胞肿瘤临床生物学行为演进过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料来源
本实验52例不同级别星形细胞肿瘤系选自青岛大学医学院附属医院病理科1999年1月~2003年1月存档组织蜡块。按1993年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准分类：星形细胞瘤(WHO Ⅱ级)14例、间变性星形细胞瘤(WHO Ⅲ级)20例、胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)18例。其中，男36例，女22例，年龄13~78岁。另外取非肿瘤脑组织4例作为研究对照。所有病例的组织蜡块均做5 μm厚连续切片，1张苏木精伊红染色，其余3张分别备MMP2、TIMP1和TIMP2免疫组化染色。
1.2 试剂来源
购自美国Santa Cruz公司的TIMP1、MMP2、TIMP2鼠抗人单克隆抗体，北京中山生物试剂公司的SP试剂盒、DAB显色试剂盒和POLYA防脱片剂。
1.3 检测方法
采用免疫组化SP三步法。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。
1.4 结果判定
MMP2、TIMP1和TIMP2阳性染色均为细胞浆内或细胞膜上出现棕黄色颗粒。采用HPIAS100高清晰度彩色病理图像分析系统观察免疫组化结果。随机选取5个高倍镜视野，计数阳性细胞数，阳性细胞数<5%为阴性(-)；阳性细胞数5%~29%为弱阳性(+)；阳性细胞数30%~60%为中强阳性()；阳性细胞数>60%为强阳性()。
1.5 统计学处理
数据以SPSS 11.0软件处理, 组间比较采用等级秩和检验。
2 结果
2.1 MMP2、TIMP1、TIMP2在正常组织表达
正常组织或非瘤脑组织中，MMP2、TIMP1、TIMP2均有表达，阳性着色位于内皮细胞胞浆和基底膜。
2.2 MMP2、TIMP1、TIMP2在星形细胞肿瘤组织中的表达
在星形细胞肿瘤中，MMP2、TIMP1、TIMP2表达阳性着色主要见于部分瘤细胞的胞浆，也见于血管基底膜和血管内皮细胞，其中瘤巨细胞多呈强阳性表达。不同级别的星形细胞肿瘤组织，MMP2、TIMP1、TIMP2的阳性表达强度差别具有统计学意义(Hc=7.966～10.353，P<0.05)。见表1。
表1 星形细胞肿瘤组织MMP2、TIMP1、TIMP2的表达(略)
3 讨论
星形细胞源肿瘤包括了具有不同侵袭能力的一大类肿瘤。其瘤细胞的侵袭生长，必然通过基质成分的改变及破坏得以实现。而MMPs与TIMPs是维持ECM平衡关系之酶系，在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用[2]，研究MMPs和TIMPs在星形细胞肿瘤中的表达对认识和了解星形细胞肿瘤的生物学行为是必要的。
本研究结果显示，MMP2、TIMP1和TIMP2的阳性表达水平在星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤与胶质母细胞瘤之间差别均具有统计学意义。表明MMP2、TIMP1和TIMP2与星形细胞肿瘤的恶性程度有关，其在星形细胞肿瘤的演进过程中具有不可忽视的作用，与星形细胞肿瘤临床生物学行为密切相关；其表达率的不同是星形细胞肿瘤在演进过程中瘤细胞异质化的结果，也是不同侵袭能力的瘤细胞亚群形成的反映。因此，可以作为判断低度恶性和高度恶性星形细胞肿瘤的免疫学形态指标。
MMP2表达率随星形细胞肿瘤恶性程度的升高而升高，可理解为MMP2阳性表达增强使星形细胞肿瘤的侵袭性生长能力加强，在肿瘤的生物学行为的演进中扮演着重要角色。但是，在本研究中TIMP1和TIMP2的阳性表达与MMP2的阳性表达平行的检测结果，在客观上与其功能相悖。分析其原因，认为它们与MMP2间的相互作用和平衡与肿瘤的侵袭性有关。体外研究证明TIMPs具有抑制星形细胞瘤侵袭的作用，而这一作用正是通过抑制MMPs实现的[3]。TIMPs的升高可能是MMPs升高的伴随结果，目的为抑制MMPs作用，抑制肿瘤的侵袭。关于TIMP在胶质瘤中的表达有不同的研究报道。MOHANAM等[4]报道，TIMP1和TIMP2在正常脑组织和肿瘤组织中均有表达，但在高度侵袭性的胶质母细胞瘤中表达较低。低级别的中枢神经系统肿瘤比高级别的肿瘤分泌更多的TIMP，从而可以解释它们侵袭力的不同。NAKANO等[5]的研究结果却表明，TIMP1的表达与肿瘤的恶性程度呈正相关。NUTTALL等[6]研究结果表明，在胶质瘤特别是在恶性胶质瘤中MMPs和TIMPs的表达水平是同时升高的。本研究显示，TIMP1、TIMP2与MMP2在星形细胞肿瘤特别是高级别星形细胞肿瘤中是同时过度表达的，支持后二者的观点。
MMP2、TIMP1和TIMP2表达阳性的组织中并非所有瘤细胞均着色，而是仅有部分瘤细胞着色，TIMP1和TIMP2在星形细胞瘤中的阳性表达较弱，且均小于中强阳性。说明MMP2、TIMP1、TIMP2三者的表达活性存在着不平衡。TIMPs是MMPs的特异性抑制因子，能够抑制MMPs的活性和肿瘤细胞侵袭，MMP2与TIMPs比例的失衡可能是导致肿瘤侵袭的另一重要原因。
本研究结果显示，正常或非瘤脑组织和星形细胞肿瘤中MMP2、TIMP1、TIMP2在血管内皮细胞和基底膜上均有表达，提示其与肿瘤演进过程、促进肿瘤血管生成有关。新生血管的形成是从基底膜的降解开始的，最接近血管形成刺激因子的静脉基底膜降解内皮细胞伸长，形成血管芽伸入细胞外基质，最终形成新的血管和基底膜。体外研究表明，血管内皮细胞可产生MMPs和TIMPs[7]。血管基底膜上60%～80%的成分是Ⅳ型胶原，而Ⅳ型胶原正是MMP2的底物之一[8]，活化的血管内皮细胞增殖，合成MMP2降解基底膜基质，形成有利于血管细胞迁移的微环境。TIMP1、TIMP2在血管内皮细胞和基底膜上的表达显示其参与血管形成，主要通过抑制MMPs来影响血管的发生。肿瘤的生长和侵袭有赖于新生血管的形成，MMP2、TIMP1、TIMP2通过参与新生血管的形成而影响星形细胞肿瘤的侵袭性生物学行为的演进过程。
总之，MMP2、TIMP1和TIMP2在星形细胞肿瘤中的表达与星形细胞肿瘤的侵袭性生物学行为密切相关，MMP2与TIMPs之间的平衡在此过程中也起着重要的作用；MMP2、TIMP1和TIMP2参与肿瘤血管生成也是影响星形细胞肿瘤生物学行为的重要因素。
[参考文献]
[1]KLAUS L, UWE M, MRCIA R , et al. Expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in human brain tumors [J]. Am J Pathol, 1998,153:429.
[2]FORSYTH P A, WONG H, LAING T D, et al. Gelatinase A(MMP2), gelatinaseB(MMP9)and membrane type matrix metalloproteinase1(MTMMP) are involved in different aspects of the pathophysiology of malifnant gliomas[J]. Br J Cancer, 1999,79(11/12):1828.
[3]MOHANAM S, WANG S W, RAYFORD A, et al. Expression of tissue inhibitors of metalloproteinases: negative regulators of human glioblastoma invasion in vivo[J]. Clin Exp Metastasis, 1995,13(1):57.
[4]MOHANAM S, WANG W W, RAYFORD A, et al. Expression of tissue inhibitors of metalloproteinases: negative regulators of human glioblastoma invasion in vivo [J]. Clin Exp Metastasis, 1995,13:57.
[5]NAKANO A, TANI E, MIYAZAKI K, et al. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteases in human gliomas [J]. J Neurosurg, 1995,83:208.
[6]NUTTALL R K, PENNINGTON C J, TAPLIN J, et al. Elevated membranetype matrix metalloproteinases in gliomas revealed by profiling proteases and inhibitors in human cancer cells[J].Mol Cancer Res, 2003,1(5):333.
[7]HERRON G S, WERB Z, DWYER K, et al. Secretion of metalloproteinases by stimulated capillary endothelial cells.Ⅰ.Production of procollagenase and prostromelysin exceeds expression of proteolytic activity[J]. Biol Chem, 1986,261:2810.
[8]KACHRA Z, BEAULIEU E, DELBECCHI L, et al. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human brain tumors [J].Clin Exp Metastasis, 1999,17(7):555.
(本文编辑 马伟平)
[作者简介]聂文洁(1972)，女，主治医师，青岛大学医学院病理学在职研究生。
[通讯作者]纪祥瑞(1950)，男，硕士，教授，硕士生导师，电话053282911533，邮编266003。
(青岛万杰医院病理科，山东 青岛 266101；青岛大学医学院病理学教研室), 百拇医药(聂文洁，迟菁华，纪祥瑞，王良忠)