结核分枝杆菌esat6cfp10融合基因疫苗的构建及表达
Construction and expression of fused gene vaccine esat6cfp10 of Mycobacterium tuberculosis
ZHANG Hai, SHI ChangHong, XUE Ying, JIANG Hong, GAO Xue, BAI YinLan, WANG LiMei, XU ZhiKai
Department of Microbiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To construct and express fused gene vaccine esat6cfp10 of Mycobacterium tuberculosis. METHODS: cfp10 gene was amplified by PCR from H37Rv virulent strain of MTB and was then inserted into pGEM7zf(+) cloning vector containing esat6 gene. After sequenced, the esat6cfp10 fused gene was cloned into eukaryotic vector pcDNA3.1(+). This recombinant plasmid was transfected into Chinese Hamster Ovary (CHO) cells by cation liposome. The expression of mRNA and the fused protein were detected by RTPCR and indirect immunofluorescence technique. RESULTS: The length of PCR product was 350 bp, identical with that reported by GenBank. The 630 bp fragment of the fused esat6cfp10 gene was obtained by restriction enzyme digestion. RTPCR suggested that the mRNA was expressed in CHO cells and the positive cells were stained positively by indirect immunofluorescence technique. CONCLUSION: cfp10 gene was successfully cloned and the eukaryotic recombinant plasmid fused esat6cfp10 was constructed successfully and expressed in CHO cells.
【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; esat6; cfp10; gene vaccine; eukaryotic expression
【摘要】 目的：构建结核分枝杆菌esat6cfp10融合基因疫苗并对其在体外进行表达. 方法：用PCR技术从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因，以HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后克隆入含esat6基因的pGEM7zf(+)载体中，将测序正确的esat6cfp10融合基因按照BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体转染CHO细胞，分别以RTPCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果：PCR获得的cfp10基因序列与文献报道一致，大小约为350 bp. 重组真核表达质粒酶切后可获得约630 bp的融合esat6cfp10基因片段. RTPCR可获得大小约为350 bp的cfp10基因，间接免疫荧光检测后表达有Esat6Cfp10蛋白的阳性细胞着染. 结论：成功克隆结核分枝杆菌cfp10基因，构建了融合有esat6cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行了表达.
【关键词】 结核分枝杆菌；esat6；cfp10；基因疫苗；真核表达
0引言
ESAT6抗原是结核杆菌早期分泌性低分子量蛋白，能诱导机体产生强烈T细胞免疫应答和释放高水平IFNγ. 许多研究表明ESAT6蛋白具有良好的抗原刺激性. 近年来又发现另一种低分子量结核杆菌培养滤液蛋白CFP10,CFP10与ESAT6同属于ESAT6家族，且由同一操纵子调控，与结核分枝杆菌毒力有关，也能释放高水平的IFNγ[1]. 传统用于预防结核病的BCG疫苗免疫效果不稳定，因此有必要研究一种比BCG更好的疫苗来控制该病的传播与蔓延[2]. 我们构建了esat6cfp10融合基因疫苗并对其进行了体外表达，为进一步探讨其在MTB中的作用奠定基础.
1材料和方法
1.1材料结核杆菌H37Rv毒株由本校基础部微生物学教研室保存. 克隆载体pGEM7Zf(+)，真核表达载体pcDNA3.1(+)，含esat6基因的重组质粒pGES6和E.coli DH5α菌株由本室保存. pfu Taq酶购自上海博亚生物公司. TRIzol为Promega公司产品，限制性内切酶、T4 DNA连接酶和核酸分子量标准品由宝泰克公司提供. 质粒提取试剂盒购自OMEGA公司. 梭华soft脂质体为厦门太阳马公司产品. SuperscriptTM逆转录试剂盒购自Gibco公司. 羊抗鼠荧光抗体购自宝信公司.
1.2方法
1.2.1结核杆菌H37Rv株基因组DNA的提取与纯化结核杆菌H37Rv株接种于7H9培养基于37℃培养7 wk，DNA的提取与纯化参照文献[3]进行.
1.2.2PCR引物设计及目的基因扩增参照GenBank发表的cfp10基因序列设计一对引物，为了保证这两种蛋白具有各自的空间构像，在上游引物中引入了48 bp的linker. 上游引物P1: GCCAAGCTTGGTGGCTCAGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGG
AGGATCAATGGCAGAGATGAAGACCG(下划线为HindⅢ酶切位点，斜体为linker)，下游引物P2: CGCGAATTCTCAGAAGCCCCATTTGCGAGGAC(下划线为EcoRⅠ酶切位点). PCR扩增体系中所用模板为结核杆菌H37Rv基因组DNA，反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，共进行30个循环，末次循环后72℃延伸2 min，扩增产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测.
1.2.3重组质粒的构建及鉴定以BamHⅠ和HindⅢ双酶切pGES6质粒获得esat6基因，凝胶回收后亚克隆至pGEM7Zf(+)，命名为pGEMe6. 再分别以HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pGEMe6和PCR产物，经T4连接酶作用后构建成含有esat6和cfp10基因的重组质粒pGEM610. 测序正确后以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM610和真核表达载体pcDNA3.1(+)，回收连接后获得重组质粒pcDNA610. 质粒提取、DNA片断回收、连接转化均按文献[2]进行. 以BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pcDNA610，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒.
1.2.4脂质体转染将2×105 CHO细胞接种于24孔板，转染前用不含抗生素的1640培养液洗2次，以0.5 mL 1640培养液重悬细胞. pcDNA610重组质粒5 μL和脂质体2 μL各用30 μL无血清的1640培养液稀释，两者混匀后室温作用20 min，缓慢加入到细胞中，继续培养24 h后收集细胞进行RTPCR和间接免疫荧光检测. 同时设不加任何处理的CHO 细胞作对照.
1.2.5RTPCR检测mRNA表达细胞总RNA提取按TRIzol试剂盒说明书进行. 取10 μL mRNA溶液，加入2 μL Oligo(dT)12-18引物，70℃水浴10 min后，立即置于冰上，加5×First Strand Buffer 4 μL, 0.1 mol/L DTT 2 μL, 10 mmol/L dNTPs 1 μL，混匀后，42℃水浴2 min，再加SuperscriptⅡ 1 μL，42℃水浴50 min后，70℃水浴15 min，灭活反转录酶. PCR反应条件为在50 μL的反应体系中，加入cDNA第一链2 μL，其余同前.
1.2.6间接免疫荧光检测目的基因表达按参考文献[4]进行. 一抗采用抗ESAT6CFP10多克隆抗体.
2结果
2.1目的基因的PCR扩增PCR产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳后发现，其阳性扩增片断大约为350 bp(Fig 1)，与Berthet等[1]的报道基本一致.
图1cfp10基因PCR扩增结果 略
2.2重组质粒的酶切鉴定重组质粒pcDNA610被BamHⅠ, EcoRⅠ双酶切后可得到约630 bp的片段，与esat6和cfp10的大小之和相一致(Fig 2)，经测序后读框正确.
图2重组质粒的酶切鉴定 略
2.3重组质粒转染CHO细胞的RTPCR结果重组质粒转染24 h后提取转染细胞的mRNA进行RTPCR反应, 结果可得到350 bp的片段，与cfp10的大小一致(Fig 3).
2.4间接免疫荧光检测融合蛋白表达转染后24 h收集细胞，进行间接免疫荧光检测. 表达有ESAT6CFP10融合蛋白的CHO细胞有荧光出现，个别细胞呈现强阳性, 而对照细胞没有着染(Fig 4).
图-图4 略
3讨论
近年来，国内外学者在发展新型结核病疫苗方面进行了一系列研究，其中包括基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗，但这些研究大多是针对结核杆菌单个免疫保护性抗原进行的，其免疫保护效果不十分理想[5,6]，因此如何提高结核病基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗的有效性成为当务之急. 有学者认为，研制包含多个免疫保护性抗原的多价基因工程亚单位疫苗可能是提高其有效性的一种新策略[7]. 有鉴于此，本研究对结核杆菌两种重要免疫保护性抗原ESAT6和CFP10进行融合表达，以便进一步研究其在结核病基因工程疫苗中的应用.
结核分枝杆菌有多种分泌性蛋白，其中早期分泌性抗原ESAT6(Mr 6000)和培养滤液蛋白CFP10(Mr 10 000)是从短期培养滤液中分离的两种低分子量蛋白，这两个蛋白同属于ESAT6家族，且由同一操纵子调控，与结核分支杆菌毒力有关. 研究发现esat6家族中的成员，esat6，cfp10，TB10.4均能诱导机体产生高水平的IFNγ，esat6和cfp10在结核病的防治中发挥比较重要的作用[8]. 在BCG传代过程中，esat6和cfp10基因发生丢失，而在绝大多数毒株中这两个基因都存在，表明BCG保护率不佳可能与这两个基因有关[9]. DNA疫苗不仅可诱导机体体液免疫反应，还可以激发特异的细胞免疫应答，因此结核DNA疫苗在结核病的防治中具有重要意义[10]. ESAT6和CFP10都是非常重要的免疫优势抗原，可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫应答的发生[11]，因此，现认为esat6和cfp10基因是构建结核DNA疫苗的有效目的基因之一. 本研究构建结核杆菌融合基因esat6cfp10真核表达质粒并研究其在CHO细胞中表达，结果提示此重组质粒可在哺乳动物细胞中表达，为进一步研究结核DNA疫苗奠定了基础.
【参考文献】
[1] Berthet F, Rasmussen P, Rosenkrands I, et al. A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT6 and a novel lowmoleclarmass culture filtrate protein(CFP10)[J]. Microbiology, 1998; 144(11):3195-3203.
[2] Kumar H, Malhotra D, Goswami S, et al. How far have we reached in tuberculosis vaccine development? [J ]. Crit Rev Microbiol, 2003;29(4):297-312.
[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999:584-590.
[4] 徐志凯. 单克隆抗体技术[M]. 西安：陕西科学技术出版社，1992:54-55.
[5] Morris S, Kelley C, Howard A, et al. The immunogenicity of single and combination DNA vaccines against tuberculosis [J]. Vaccine, 2000; 18(20):2155-2163.
[6] Brandt L, Oettinger T, Holm A, et al. Key epitopes on the esat6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis[J]. J Immunol, 1996; 157(8): 3527-3533.
[7] Orme IM. Beyond BCG: The potential for a more effective TB vaccine[J]. Mol Med Today, 1999;5(11):487-492.
[8] Skjot R, Oettinger T, Rosenkrands I, et al. Comparative evaluation of lowmolecularmass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the esat6 family as immunodominant Tcell antigens[J]. Infect Immun, 2000;68(1):214-220.
[9] Pym S, Brodin P, Brosch R, et al. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti[J]. Mol Microbiol, 2002;46(3):709-717.
[10] 范雄林，王丽梅，师长宏，等. 结核杆菌cfp10真核载体的构建、表达与基因免疫[J]. 第四军医大学学报，2003；24(10)：867-869.Fan XL, Wang LM, Shi CH, et al. Construction，expression and gene immunization of eukaryotic expression vector containing cfp10 of Mycobacterium tuberculosis[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(10):867-869.
[11] 师长宏，范雄林，柏银兰，等. 结核分枝杆菌Ag85BESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力[J]. 第四军医大学学报，2004；25(18)：1633-1636.Shi CH, Fan XL, Bai YL, et al. Immunity responses and protective efficacy induced by Mycobacterium tuberculosis Ag85BESAT6 fusion protein in mice[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25(18):1633-1636.
基金项目：国家“863”课题(2001AA215201);国家自然科学基金(30400381)
第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033
编辑甄志强, 百拇医药(张海，师长宏，薛莹，姜泓，高雪，柏银兰，王丽梅，徐)
ZHANG Hai, SHI ChangHong, XUE Ying, JIANG Hong, GAO Xue, BAI YinLan, WANG LiMei, XU ZhiKai
Department of Microbiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To construct and express fused gene vaccine esat6cfp10 of Mycobacterium tuberculosis. METHODS: cfp10 gene was amplified by PCR from H37Rv virulent strain of MTB and was then inserted into pGEM7zf(+) cloning vector containing esat6 gene. After sequenced, the esat6cfp10 fused gene was cloned into eukaryotic vector pcDNA3.1(+). This recombinant plasmid was transfected into Chinese Hamster Ovary (CHO) cells by cation liposome. The expression of mRNA and the fused protein were detected by RTPCR and indirect immunofluorescence technique. RESULTS: The length of PCR product was 350 bp, identical with that reported by GenBank. The 630 bp fragment of the fused esat6cfp10 gene was obtained by restriction enzyme digestion. RTPCR suggested that the mRNA was expressed in CHO cells and the positive cells were stained positively by indirect immunofluorescence technique. CONCLUSION: cfp10 gene was successfully cloned and the eukaryotic recombinant plasmid fused esat6cfp10 was constructed successfully and expressed in CHO cells.
【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; esat6; cfp10; gene vaccine; eukaryotic expression
【摘要】 目的：构建结核分枝杆菌esat6cfp10融合基因疫苗并对其在体外进行表达. 方法：用PCR技术从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因，以HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后克隆入含esat6基因的pGEM7zf(+)载体中，将测序正确的esat6cfp10融合基因按照BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体转染CHO细胞，分别以RTPCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果：PCR获得的cfp10基因序列与文献报道一致，大小约为350 bp. 重组真核表达质粒酶切后可获得约630 bp的融合esat6cfp10基因片段. RTPCR可获得大小约为350 bp的cfp10基因，间接免疫荧光检测后表达有Esat6Cfp10蛋白的阳性细胞着染. 结论：成功克隆结核分枝杆菌cfp10基因，构建了融合有esat6cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行了表达.
【关键词】 结核分枝杆菌；esat6；cfp10；基因疫苗；真核表达
0引言
ESAT6抗原是结核杆菌早期分泌性低分子量蛋白，能诱导机体产生强烈T细胞免疫应答和释放高水平IFNγ. 许多研究表明ESAT6蛋白具有良好的抗原刺激性. 近年来又发现另一种低分子量结核杆菌培养滤液蛋白CFP10,CFP10与ESAT6同属于ESAT6家族，且由同一操纵子调控，与结核分枝杆菌毒力有关，也能释放高水平的IFNγ[1]. 传统用于预防结核病的BCG疫苗免疫效果不稳定，因此有必要研究一种比BCG更好的疫苗来控制该病的传播与蔓延[2]. 我们构建了esat6cfp10融合基因疫苗并对其进行了体外表达，为进一步探讨其在MTB中的作用奠定基础.
1材料和方法
1.1材料结核杆菌H37Rv毒株由本校基础部微生物学教研室保存. 克隆载体pGEM7Zf(+)，真核表达载体pcDNA3.1(+)，含esat6基因的重组质粒pGES6和E.coli DH5α菌株由本室保存. pfu Taq酶购自上海博亚生物公司. TRIzol为Promega公司产品，限制性内切酶、T4 DNA连接酶和核酸分子量标准品由宝泰克公司提供. 质粒提取试剂盒购自OMEGA公司. 梭华soft脂质体为厦门太阳马公司产品. SuperscriptTM逆转录试剂盒购自Gibco公司. 羊抗鼠荧光抗体购自宝信公司.
1.2方法
1.2.1结核杆菌H37Rv株基因组DNA的提取与纯化结核杆菌H37Rv株接种于7H9培养基于37℃培养7 wk，DNA的提取与纯化参照文献[3]进行.
1.2.2PCR引物设计及目的基因扩增参照GenBank发表的cfp10基因序列设计一对引物，为了保证这两种蛋白具有各自的空间构像，在上游引物中引入了48 bp的linker. 上游引物P1: GCCAAGCTTGGTGGCTCAGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGG
AGGATCAATGGCAGAGATGAAGACCG(下划线为HindⅢ酶切位点，斜体为linker)，下游引物P2: CGCGAATTCTCAGAAGCCCCATTTGCGAGGAC(下划线为EcoRⅠ酶切位点). PCR扩增体系中所用模板为结核杆菌H37Rv基因组DNA，反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，共进行30个循环，末次循环后72℃延伸2 min，扩增产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测.
1.2.3重组质粒的构建及鉴定以BamHⅠ和HindⅢ双酶切pGES6质粒获得esat6基因，凝胶回收后亚克隆至pGEM7Zf(+)，命名为pGEMe6. 再分别以HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pGEMe6和PCR产物，经T4连接酶作用后构建成含有esat6和cfp10基因的重组质粒pGEM610. 测序正确后以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM610和真核表达载体pcDNA3.1(+)，回收连接后获得重组质粒pcDNA610. 质粒提取、DNA片断回收、连接转化均按文献[2]进行. 以BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pcDNA610，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒.
1.2.4脂质体转染将2×105 CHO细胞接种于24孔板，转染前用不含抗生素的1640培养液洗2次，以0.5 mL 1640培养液重悬细胞. pcDNA610重组质粒5 μL和脂质体2 μL各用30 μL无血清的1640培养液稀释，两者混匀后室温作用20 min，缓慢加入到细胞中，继续培养24 h后收集细胞进行RTPCR和间接免疫荧光检测. 同时设不加任何处理的CHO 细胞作对照.
1.2.5RTPCR检测mRNA表达细胞总RNA提取按TRIzol试剂盒说明书进行. 取10 μL mRNA溶液，加入2 μL Oligo(dT)12-18引物，70℃水浴10 min后，立即置于冰上，加5×First Strand Buffer 4 μL, 0.1 mol/L DTT 2 μL, 10 mmol/L dNTPs 1 μL，混匀后，42℃水浴2 min，再加SuperscriptⅡ 1 μL，42℃水浴50 min后，70℃水浴15 min，灭活反转录酶. PCR反应条件为在50 μL的反应体系中，加入cDNA第一链2 μL，其余同前.
1.2.6间接免疫荧光检测目的基因表达按参考文献[4]进行. 一抗采用抗ESAT6CFP10多克隆抗体.
2结果
2.1目的基因的PCR扩增PCR产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳后发现，其阳性扩增片断大约为350 bp(Fig 1)，与Berthet等[1]的报道基本一致.
图1cfp10基因PCR扩增结果 略
2.2重组质粒的酶切鉴定重组质粒pcDNA610被BamHⅠ, EcoRⅠ双酶切后可得到约630 bp的片段，与esat6和cfp10的大小之和相一致(Fig 2)，经测序后读框正确.
图2重组质粒的酶切鉴定 略
2.3重组质粒转染CHO细胞的RTPCR结果重组质粒转染24 h后提取转染细胞的mRNA进行RTPCR反应, 结果可得到350 bp的片段，与cfp10的大小一致(Fig 3).
2.4间接免疫荧光检测融合蛋白表达转染后24 h收集细胞，进行间接免疫荧光检测. 表达有ESAT6CFP10融合蛋白的CHO细胞有荧光出现，个别细胞呈现强阳性, 而对照细胞没有着染(Fig 4).
图-图4 略
3讨论
近年来，国内外学者在发展新型结核病疫苗方面进行了一系列研究，其中包括基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗，但这些研究大多是针对结核杆菌单个免疫保护性抗原进行的，其免疫保护效果不十分理想[5,6]，因此如何提高结核病基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗的有效性成为当务之急. 有学者认为，研制包含多个免疫保护性抗原的多价基因工程亚单位疫苗可能是提高其有效性的一种新策略[7]. 有鉴于此，本研究对结核杆菌两种重要免疫保护性抗原ESAT6和CFP10进行融合表达，以便进一步研究其在结核病基因工程疫苗中的应用.
结核分枝杆菌有多种分泌性蛋白，其中早期分泌性抗原ESAT6(Mr 6000)和培养滤液蛋白CFP10(Mr 10 000)是从短期培养滤液中分离的两种低分子量蛋白，这两个蛋白同属于ESAT6家族，且由同一操纵子调控，与结核分支杆菌毒力有关. 研究发现esat6家族中的成员，esat6，cfp10，TB10.4均能诱导机体产生高水平的IFNγ，esat6和cfp10在结核病的防治中发挥比较重要的作用[8]. 在BCG传代过程中，esat6和cfp10基因发生丢失，而在绝大多数毒株中这两个基因都存在，表明BCG保护率不佳可能与这两个基因有关[9]. DNA疫苗不仅可诱导机体体液免疫反应，还可以激发特异的细胞免疫应答，因此结核DNA疫苗在结核病的防治中具有重要意义[10]. ESAT6和CFP10都是非常重要的免疫优势抗原，可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫应答的发生[11]，因此，现认为esat6和cfp10基因是构建结核DNA疫苗的有效目的基因之一. 本研究构建结核杆菌融合基因esat6cfp10真核表达质粒并研究其在CHO细胞中表达，结果提示此重组质粒可在哺乳动物细胞中表达，为进一步研究结核DNA疫苗奠定了基础.
【参考文献】
[1] Berthet F, Rasmussen P, Rosenkrands I, et al. A Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT6 and a novel lowmoleclarmass culture filtrate protein(CFP10)[J]. Microbiology, 1998; 144(11):3195-3203.
[2] Kumar H, Malhotra D, Goswami S, et al. How far have we reached in tuberculosis vaccine development? [J ]. Crit Rev Microbiol, 2003;29(4):297-312.
[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999:584-590.
[4] 徐志凯. 单克隆抗体技术[M]. 西安：陕西科学技术出版社，1992:54-55.
[5] Morris S, Kelley C, Howard A, et al. The immunogenicity of single and combination DNA vaccines against tuberculosis [J]. Vaccine, 2000; 18(20):2155-2163.
[6] Brandt L, Oettinger T, Holm A, et al. Key epitopes on the esat6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis[J]. J Immunol, 1996; 157(8): 3527-3533.
[7] Orme IM. Beyond BCG: The potential for a more effective TB vaccine[J]. Mol Med Today, 1999;5(11):487-492.
[8] Skjot R, Oettinger T, Rosenkrands I, et al. Comparative evaluation of lowmolecularmass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the esat6 family as immunodominant Tcell antigens[J]. Infect Immun, 2000;68(1):214-220.
[9] Pym S, Brodin P, Brosch R, et al. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti[J]. Mol Microbiol, 2002;46(3):709-717.
[10] 范雄林，王丽梅，师长宏，等. 结核杆菌cfp10真核载体的构建、表达与基因免疫[J]. 第四军医大学学报，2003；24(10)：867-869.Fan XL, Wang LM, Shi CH, et al. Construction，expression and gene immunization of eukaryotic expression vector containing cfp10 of Mycobacterium tuberculosis[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(10):867-869.
[11] 师长宏，范雄林，柏银兰，等. 结核分枝杆菌Ag85BESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力[J]. 第四军医大学学报，2004；25(18)：1633-1636.Shi CH, Fan XL, Bai YL, et al. Immunity responses and protective efficacy induced by Mycobacterium tuberculosis Ag85BESAT6 fusion protein in mice[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25(18):1633-1636.
基金项目：国家“863”课题(2001AA215201);国家自然科学基金(30400381)
第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033
编辑甄志强, 百拇医药(张海，师长宏，薛莹，姜泓，高雪，柏银兰，王丽梅，徐)