GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA在不同年龄大鼠SVZ和海马表达的变化及其意义
[摘要]目的: 观察不同年龄SD大鼠脑室管膜下区(SVZ)和海马GDNFmRNA及其受体GFR.α 1 mRNA表达水平的变化，探讨其在神经发生及脑老化中的作用。 方法: 用RT.PCR方法检测胚胎18d、新生以及1、3、8、12月龄SD大鼠SVZ和海马GDNFmRNA及其受体GFR.α 1 mRNA的变化。 结果: 随着年龄增长，SD大鼠SVZ和海马GDNFmRNA及其受体GFR.α 1 mRNA表达水平逐渐降低。且各年龄组海马表达参数的幅度小于SVZ。 结论: GDNF及其受体GFR.α 1 在神经发育及脑老化进程中起到一定的作用。
[关键词] 脑室管膜下区;海马;胶质细胞源性神经营养因子;胶质细胞源性神经营养因子受体.α 1 ;大鼠
近年来神经科学研究的一项重要进展是，发现成年哺乳动物脑内某些特定区域在正常状态下存在神经发生现象。其中脑室管膜下区(subventricular zone，SVZ)和海马颗粒下层(subgranular layer zone，SGZ)已被证实是神经前体细胞产生最为活跃的区域[1，2] 。成年脑的神经发生现象局限于特定的脑区，提示相关生发脑区的微环境可能对神经发生起着重要作用。也有的研究证明微环境的变化与脑老化的过程相关。脑的神经发生与脑老化有可能就是微环境变化影响神经前体细胞的结果。神经生长因子是目前研究最多的调节因子，在体内外，EGF、FGF、IGF.1等均可刺激SVZ细胞增殖，甚至可以调节神经前体细胞的定向分化[3，4] 。转化生长因子.β(transforming growth factor.β，TGF.β)超家族成员的胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-de-rived neurotrophic factor，GDNF)是现有神经营养因子作用最强的一种[5] ，因其广泛的神经营养作用及潜在的促神经前体细胞分化作用而成为近年来的研究热点。
GDNF的受体由固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇(GPI)，称为GDNF家族受体α 1-4 (GDNF family recep-torα 1-4 ，GFR.α 1-4 )和GDNF功能性受体孤儿酪氨酸RET蛋白(由原癌基因C.RET编码)所组成。当GDNF结合于GFR.α(主要高亲和性地结合于GFR.α1 )时，通过招募RET蛋白形成受体复合物激活下游信号转导途径，从而产生生物学效应[6] 。另外研究发现，缺乏RET时，GDNF通过激活GFR.α 1 相关Src蛋白样激酶途径进行信号转导[7] ，故GDNF信号转导途径具有依赖和不依赖RET蛋白两种方式，而GFR.α 1 是两者的关键信号转导分子。
现在已知中枢神经系统的可塑性和修复能力随年龄的增加而下降，神经发生现象也随年龄增加而降低，但作为具有广泛的神经营养作用及潜在的促神经前体细胞分化作用的GDNF及其受体GFR.α 1 ，在不同年龄大鼠的表达水平是否与神经发生有关?其增龄变化目前还不是很清楚，尤其从分子水平研究GDNF及其受体的增龄性变化尚未见报道。本研究采用RT.PCR方法观察了不同年龄大鼠GDNF及其受体GFR.α 1 在SVZ、海马的表达变化，探讨其在神经发生及脑老化进程中的生物学意义。
1 材料与方法
1.1 材料
RNA抽提试剂盒TrizolReagent(Gibco)，RT.PCR试剂盒(TaKaRa)，Tris碱、溴酚蓝、EB、EDTA、琼脂糖，SDS(上海生工生物工程公司)，DEPC(Fluka公司)，DNA分子质量标准DNA Marker DL2000(TaKaRa)。GDNF分子引物序列:上游引物5′.GACTCCAATGTGCCCGAAGA.3′，下游引物5′.CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC.3′，该引物产生394bp的cDNA片段;GFR.α 1 分子引物序列:上游引物5′.CTGGAAAGATGAACCGATTG.3′，下游引物5′.CTCTGTGAGAGGGTGAGAAG.3′，该引物产生290bp的cDNA片段。上述引物由作者潘秋辉设计。β.actin分子引物序列:上游引物5′.ATGCCATCCTGCGTCTGGA CCTGGC.3′，下游引物5′.AGCATTTGCGGTGCACGATGG AGGG.3′，该引物产生603bp的cDNA片段，上述引物序列由上海生工生物工程公司合成。
1.2 动物分组与取材
SD大鼠每组4只，分为孕18d(取胚胎)、新生以及1、3、8、12月龄6组(由中山大学第二附属医院实验动物中心提供)。孕18d组大鼠以0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在体视显微镜下取出胚胎，快速分离胚胎大脑组织，显微镜下分离侧脑室周围区域与海马，用0.01mol·L -1 PBS液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。其余5组大鼠以0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，按Swanson大鼠脑图谱[8] ，于坐标bregma+1.45、bregma+0.45处进行定位，快速断头、剥离侧脑室周围区域(切取双侧侧脑室外侧壁自室腔面向外侧，其厚度约为1.0mm)[9] 与海马组织，用0.01mol·L 1 PBS液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。
1.3 RNA抽提、RT反应及PCR扩增过程
1.3.1 大鼠SVZ、海马组织RNA的抽提 分别取50～100mg脑室管膜下区和海马冻存脑组织，采用Trizol一步法获得RNA，RT和PCR反应过程前取少量作紫外扫描分析和琼脂糖电泳分析。
1.3.2 RT反应 在无Rnasin的离心管中依次加入总RNA2μl和DEPC处理水7.5μl，99℃变性5min，冰浴5min，然后加入终浓度为5mmol·L -1 的MgCl 2 4μl、1×RTbuffer2μl、1mmol·L -1 的dNTP2μl、20U的rnasin0.5μl、15U的RT1μl、Oligo(dT15)1μl，42℃水浴45min，99℃水浴5min，然后冰浴5min，产物置于-20℃保存备用。
1.3.3 PCR扩增 在0.5ml的薄壁离心管中依次加入RT产物2μl、25mmol·L -1 的MgCl 2 2μl、10×buffer4μl、终浓度为0.2mmol·L -1 的dNTP、30μmol·L -1 的Primer(GDNF、GFR.α 1 )1.2μl、1U·μl -1 的Taq酶1.5μl、DEPC处理水31.3μl、石蜡油50μl，瞬时离心后于94℃ 反应7min，然后在94℃1min、54℃1min、72℃1min下反应35个循环，最后在72℃下反应10min。产物于4℃下保存备用。β.actin扩增反应同上述步骤，用作RT.PCR检测基因表达时的阳性对照。
1.4 PCR产物检测与数据处理
PCR产物10μl上样于含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，电压降为5V·cm -1 ，凝胶扫描系统进行密度扫描后，以对应组β.actin密度为100%对照校正，用凝胶图像分析系统(leica)进行扩增产物半定量分析，得到GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA的光密度值，结果以ˉx±s表示，用t检验比较各组标本差异的显著性。
2 结果
2.1 不同年龄大鼠SVZ、海马总mRNA分析
在1%琼脂糖凝胶电泳上可见28s和18s两个清晰条带，28s与18s比值约为2∶1，未见明显降解。用紫外分光光度计测抽提的总RNA的OD 260nm 、OD 280nm 。结果显示，OD 260nm .OD 280nm >1.8。表明抽提的总RNA没有蛋白质和其他杂质的污染，纯度较高，可以用作RT的模板。总RNA得率SVZ多于海马组织。
2.2 大鼠SVZ、海马β.actin mRNA的表达
在SD大鼠SVZ、海马组织总RNA扩增出603bp DNA片段，与预计结果吻合。灰度扫描时定为100%标准。
2.3 不同年龄大鼠SVZ、海马GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA的表达
GDNFmRNART产物经PCR扩增得到约394bp的cDNA片段，GFR.α 1 mRNA RT产物经PCR扩增得到约290bp的cDNA片段，与设计结果相同。结果显示SVZ GDNFmRNA在胚胎及新生大鼠表达水平较高;出生后至成年期(1～8月龄)呈缓慢下降的趋势，各组间差异不明显，但显著低于胚胎及新生大鼠。老年期(12月龄)大鼠的GDNFmRNA表达水平则明显降低(见表1、图1)。不同年龄组SVZ GFR.α 1 mRNA表达的变化与GDNFmRNA表达的变化趋势相似。海马区GDNF mR-NA在胚胎期表达水平相对较低，新生大鼠表达水平相对胚胎期有明显上调，后随年龄的增大逐渐下降。而海马区GFR.α 1 mRNA在胚胎期表达相对较多，新生大鼠表达相对胚胎期无明显变化，后在各年龄组呈低表达，在老年大鼠未见表达或见很少量的表达(表2、图2)。
表1 不同年龄大鼠SVZ、海马GDNFmRNA表达情况(略)
Tab1 GDNFmRNA gene expression in subventricular zone and hippocampus，using semi-quantitative RT.PCR method withβ.actin as a inner consult
与孕18d鼠比较，1)P<0.05，2)P<0.01
1～6.依次代表孕18d、新生以及1、3、8、12月龄大鼠;M.Marker
图1 不同年龄大鼠海马GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA表达变化电泳图(略)
Fig1 RT.PCR analysis of GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA expression in hippocampus
1～6.依次代表孕18d、新生以及1、3、8、12月龄大鼠;M.Marker
图2 不同年龄大鼠SVZ GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA表达变化电泳图(略)
Fig2 RT.PCR analysis of GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA expression in subventricular zone
表2 不同年龄大鼠SVZ、海马GFR.α 1 mRNA表达情况(略)
Tab2 GFR.α 1 mRNA gene expression in subventricular zone and hippocampus，using semi-quantitative RT.PCR method withβ.actin as a inner consult
与新生鼠比较，1)P<0.05，2)P<0.01
3 讨论
GDNF是1993年由小鼠胶质细胞系B 49 中分离出的糖基化的二硫键结合的同源二聚体蛋白质，属于TGF.β超家族成员。最初的研究发现，GDNF具有促进大鼠胚胎中脑多巴胺能神经元存活、形态分化和增强其摄取多巴胺的能力。近年来的实验证实，GDNF是一种多效能神经营养因子，对中枢及周围神经系统不同种类神经元的发育、存活及再生有一定的支持作用。Jing等采用“表达克隆法(expression cloning)发现了与GDNF有高亲和力的受体蛋白GFRα 1 (原先命名为GDNFRα)[10] 。由于GFR.α 1 是GDNF发挥生物学效应的关键信号转导分子，因此，GFR.α 1 的表达与GDNF发挥其神经营养作用及促神经前体细胞分化作用密不可分。
目前，成年哺乳动物脑的SVZ和SGZ存在神经前体细胞的观念已为很多人所接受，有关神经前体细胞的各种研究也正在全面展开。现有的研究结果表明，随着年龄的增长，脑内SVZ和SGZ神经前体细胞增殖分化能力是减弱的[11，12] 。但有关脑生发区神经发生及脑老化与GDNF、GFR.α 1 表达的增龄性变化之间的关系还知之甚少。本研究结果显示，GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA的表达水平在出生后随年龄的增加而降低，具有增龄性变化，说明GDNF的变化可能影响神经前体细胞的发育、分化及随年龄增加而产生的脑老化过程，提示相关生发脑区的微环境在神经发生及脑老化过程中起着重要作用，同时也为GDNF用于治疗神经变性疾病提供了相关理论依据。
本实验结果显示，大鼠海马与SVZ的GFR.α 1 mR-NA在胚胎期与新生鼠呈高表达，出生后至1月龄明显下降，从3月龄起下降开始减缓;而GDNF mRNA则在新生鼠呈高表达，出生后开始下降;在12月龄组，海马与SVZ的GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA只有很少量的表达或无表达。这说明高表达的GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA不但在胚胎期及出生后早期的神经发育、分化中发挥着很重要的作用，而且其在成年期大鼠神经组织中一定水平的表达可能与神经组织的修复以及SVZ、海马维持正常功能有关。
Golden等用分子杂交的方法没有发现胚胎18d的小鼠海马GDNF mRNA的表达[13] 。但本实验发现，在胚胎18d的大鼠海马有很少量GDNF mRNA的表达，这说明GDNFmRNA的表达可能有种属差异。新生大鼠海马GDNF mRNA的表达明显升高，至生后下降。由于SGZ主要参与新生神经元的形成，并迁移整合到颗粒细胞层的神经环路中，在学习、记忆中发挥作用，这是否说明大鼠海马中与学习、记忆有关的神经元发育关键阶段是在出生及出生后一段时间内，而此时高表达的GDNF正是参与这些神经元的发育与成熟的重要因子?尚需要进一步的实验来证实。另外胚胎18d大鼠海马GDNFmRNA的表达与受体GFR.α 1 mRNA的表达发生了分离现象，这是否说明在GDNF mRNA表达很少的情况下受体反应性增加以增强GDNF的神经发育、分化作用?或者是胚胎脑其他部位表达的GD-NF作用于海马发挥其营养作用，也有待进一步的探讨。
实验中作者还发现，大鼠海马总RNA得率要少于SVZ，且各年龄组海马的GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA表达水平普遍低于SVZ。有关报道也显示，随年龄变化，SGZ的BrdU标记细胞数的减少较SVZ更为显著[11] 。这说明随着年龄的增加神经组织的自我修复能力是下降的，并且SGZ的修复能力要弱于SVZ。这些结果都为衰老时学习记忆减退作为较早出现的神经功能紊乱现象提供相关的理论依据，同时也说明GD-NF不但与神经发育、分化有关，也可能影响SGZ的神经环路的形成从而与脑老化过程相关。
[参考文献]
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[11]汪建民，袁群芳，姚志彬.大鼠室管膜下区和齿状回神经前体细胞增殖的衰老性变化[J].神经解剖学杂志，2002，18(1):17.20.
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[13]GOLDEN P J，DEMARO A J，SBORNE A P，et al.Expression of neurturin，GDNF，and GDNF family-receptor mRNA in the devel-oping and mature mouse[J].Experimental Neurology，1999，158，504.528.
[基金项目] 江苏省自然科学基金资助项目(BK2002056)。
(东南大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，江苏南京 210009;江苏省人民医院病理科，江苏南京 210029;中山大学第二附属医院林百欣实验中心，广东广州 510120), http://www.100md.com(刘方舟，杨宁，朱岩，曾水林，潘秋辉，刘云龙)
[关键词] 脑室管膜下区;海马;胶质细胞源性神经营养因子;胶质细胞源性神经营养因子受体.α 1 ;大鼠
近年来神经科学研究的一项重要进展是，发现成年哺乳动物脑内某些特定区域在正常状态下存在神经发生现象。其中脑室管膜下区(subventricular zone，SVZ)和海马颗粒下层(subgranular layer zone，SGZ)已被证实是神经前体细胞产生最为活跃的区域[1，2] 。成年脑的神经发生现象局限于特定的脑区，提示相关生发脑区的微环境可能对神经发生起着重要作用。也有的研究证明微环境的变化与脑老化的过程相关。脑的神经发生与脑老化有可能就是微环境变化影响神经前体细胞的结果。神经生长因子是目前研究最多的调节因子，在体内外，EGF、FGF、IGF.1等均可刺激SVZ细胞增殖，甚至可以调节神经前体细胞的定向分化[3，4] 。转化生长因子.β(transforming growth factor.β，TGF.β)超家族成员的胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-de-rived neurotrophic factor，GDNF)是现有神经营养因子作用最强的一种[5] ，因其广泛的神经营养作用及潜在的促神经前体细胞分化作用而成为近年来的研究热点。
GDNF的受体由固定于质膜外层的糖基磷脂酰肌醇(GPI)，称为GDNF家族受体α 1-4 (GDNF family recep-torα 1-4 ，GFR.α 1-4 )和GDNF功能性受体孤儿酪氨酸RET蛋白(由原癌基因C.RET编码)所组成。当GDNF结合于GFR.α(主要高亲和性地结合于GFR.α1 )时，通过招募RET蛋白形成受体复合物激活下游信号转导途径，从而产生生物学效应[6] 。另外研究发现，缺乏RET时，GDNF通过激活GFR.α 1 相关Src蛋白样激酶途径进行信号转导[7] ，故GDNF信号转导途径具有依赖和不依赖RET蛋白两种方式，而GFR.α 1 是两者的关键信号转导分子。
现在已知中枢神经系统的可塑性和修复能力随年龄的增加而下降，神经发生现象也随年龄增加而降低，但作为具有广泛的神经营养作用及潜在的促神经前体细胞分化作用的GDNF及其受体GFR.α 1 ，在不同年龄大鼠的表达水平是否与神经发生有关?其增龄变化目前还不是很清楚，尤其从分子水平研究GDNF及其受体的增龄性变化尚未见报道。本研究采用RT.PCR方法观察了不同年龄大鼠GDNF及其受体GFR.α 1 在SVZ、海马的表达变化，探讨其在神经发生及脑老化进程中的生物学意义。
1 材料与方法
1.1 材料
RNA抽提试剂盒TrizolReagent(Gibco)，RT.PCR试剂盒(TaKaRa)，Tris碱、溴酚蓝、EB、EDTA、琼脂糖，SDS(上海生工生物工程公司)，DEPC(Fluka公司)，DNA分子质量标准DNA Marker DL2000(TaKaRa)。GDNF分子引物序列:上游引物5′.GACTCCAATGTGCCCGAAGA.3′，下游引物5′.CCTACCTTGTCACTTGCTAGCC.3′，该引物产生394bp的cDNA片段;GFR.α 1 分子引物序列:上游引物5′.CTGGAAAGATGAACCGATTG.3′，下游引物5′.CTCTGTGAGAGGGTGAGAAG.3′，该引物产生290bp的cDNA片段。上述引物由作者潘秋辉设计。β.actin分子引物序列:上游引物5′.ATGCCATCCTGCGTCTGGA CCTGGC.3′，下游引物5′.AGCATTTGCGGTGCACGATGG AGGG.3′，该引物产生603bp的cDNA片段，上述引物序列由上海生工生物工程公司合成。
1.2 动物分组与取材
SD大鼠每组4只，分为孕18d(取胚胎)、新生以及1、3、8、12月龄6组(由中山大学第二附属医院实验动物中心提供)。孕18d组大鼠以0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在体视显微镜下取出胚胎，快速分离胚胎大脑组织，显微镜下分离侧脑室周围区域与海马，用0.01mol·L -1 PBS液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。其余5组大鼠以0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，按Swanson大鼠脑图谱[8] ，于坐标bregma+1.45、bregma+0.45处进行定位，快速断头、剥离侧脑室周围区域(切取双侧侧脑室外侧壁自室腔面向外侧，其厚度约为1.0mm)[9] 与海马组织，用0.01mol·L 1 PBS液洗净血液，快速匀浆，置于液氮中保存备用。
1.3 RNA抽提、RT反应及PCR扩增过程
1.3.1 大鼠SVZ、海马组织RNA的抽提 分别取50～100mg脑室管膜下区和海马冻存脑组织，采用Trizol一步法获得RNA，RT和PCR反应过程前取少量作紫外扫描分析和琼脂糖电泳分析。
1.3.2 RT反应 在无Rnasin的离心管中依次加入总RNA2μl和DEPC处理水7.5μl，99℃变性5min，冰浴5min，然后加入终浓度为5mmol·L -1 的MgCl 2 4μl、1×RTbuffer2μl、1mmol·L -1 的dNTP2μl、20U的rnasin0.5μl、15U的RT1μl、Oligo(dT15)1μl，42℃水浴45min，99℃水浴5min，然后冰浴5min，产物置于-20℃保存备用。
1.3.3 PCR扩增 在0.5ml的薄壁离心管中依次加入RT产物2μl、25mmol·L -1 的MgCl 2 2μl、10×buffer4μl、终浓度为0.2mmol·L -1 的dNTP、30μmol·L -1 的Primer(GDNF、GFR.α 1 )1.2μl、1U·μl -1 的Taq酶1.5μl、DEPC处理水31.3μl、石蜡油50μl，瞬时离心后于94℃ 反应7min，然后在94℃1min、54℃1min、72℃1min下反应35个循环，最后在72℃下反应10min。产物于4℃下保存备用。β.actin扩增反应同上述步骤，用作RT.PCR检测基因表达时的阳性对照。
1.4 PCR产物检测与数据处理
PCR产物10μl上样于含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶，电压降为5V·cm -1 ，凝胶扫描系统进行密度扫描后，以对应组β.actin密度为100%对照校正，用凝胶图像分析系统(leica)进行扩增产物半定量分析，得到GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA的光密度值，结果以ˉx±s表示，用t检验比较各组标本差异的显著性。
2 结果
2.1 不同年龄大鼠SVZ、海马总mRNA分析
在1%琼脂糖凝胶电泳上可见28s和18s两个清晰条带，28s与18s比值约为2∶1，未见明显降解。用紫外分光光度计测抽提的总RNA的OD 260nm 、OD 280nm 。结果显示，OD 260nm .OD 280nm >1.8。表明抽提的总RNA没有蛋白质和其他杂质的污染，纯度较高，可以用作RT的模板。总RNA得率SVZ多于海马组织。
2.2 大鼠SVZ、海马β.actin mRNA的表达
在SD大鼠SVZ、海马组织总RNA扩增出603bp DNA片段，与预计结果吻合。灰度扫描时定为100%标准。
2.3 不同年龄大鼠SVZ、海马GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA的表达
GDNFmRNART产物经PCR扩增得到约394bp的cDNA片段，GFR.α 1 mRNA RT产物经PCR扩增得到约290bp的cDNA片段，与设计结果相同。结果显示SVZ GDNFmRNA在胚胎及新生大鼠表达水平较高;出生后至成年期(1～8月龄)呈缓慢下降的趋势，各组间差异不明显，但显著低于胚胎及新生大鼠。老年期(12月龄)大鼠的GDNFmRNA表达水平则明显降低(见表1、图1)。不同年龄组SVZ GFR.α 1 mRNA表达的变化与GDNFmRNA表达的变化趋势相似。海马区GDNF mR-NA在胚胎期表达水平相对较低，新生大鼠表达水平相对胚胎期有明显上调，后随年龄的增大逐渐下降。而海马区GFR.α 1 mRNA在胚胎期表达相对较多，新生大鼠表达相对胚胎期无明显变化，后在各年龄组呈低表达，在老年大鼠未见表达或见很少量的表达(表2、图2)。
表1 不同年龄大鼠SVZ、海马GDNFmRNA表达情况(略)
Tab1 GDNFmRNA gene expression in subventricular zone and hippocampus，using semi-quantitative RT.PCR method withβ.actin as a inner consult
与孕18d鼠比较，1)P<0.05，2)P<0.01
1～6.依次代表孕18d、新生以及1、3、8、12月龄大鼠;M.Marker
图1 不同年龄大鼠海马GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA表达变化电泳图(略)
Fig1 RT.PCR analysis of GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA expression in hippocampus
1～6.依次代表孕18d、新生以及1、3、8、12月龄大鼠;M.Marker
图2 不同年龄大鼠SVZ GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA表达变化电泳图(略)
Fig2 RT.PCR analysis of GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA expression in subventricular zone
表2 不同年龄大鼠SVZ、海马GFR.α 1 mRNA表达情况(略)
Tab2 GFR.α 1 mRNA gene expression in subventricular zone and hippocampus，using semi-quantitative RT.PCR method withβ.actin as a inner consult
与新生鼠比较，1)P<0.05，2)P<0.01
3 讨论
GDNF是1993年由小鼠胶质细胞系B 49 中分离出的糖基化的二硫键结合的同源二聚体蛋白质，属于TGF.β超家族成员。最初的研究发现，GDNF具有促进大鼠胚胎中脑多巴胺能神经元存活、形态分化和增强其摄取多巴胺的能力。近年来的实验证实，GDNF是一种多效能神经营养因子，对中枢及周围神经系统不同种类神经元的发育、存活及再生有一定的支持作用。Jing等采用“表达克隆法(expression cloning)发现了与GDNF有高亲和力的受体蛋白GFRα 1 (原先命名为GDNFRα)[10] 。由于GFR.α 1 是GDNF发挥生物学效应的关键信号转导分子，因此，GFR.α 1 的表达与GDNF发挥其神经营养作用及促神经前体细胞分化作用密不可分。
目前，成年哺乳动物脑的SVZ和SGZ存在神经前体细胞的观念已为很多人所接受，有关神经前体细胞的各种研究也正在全面展开。现有的研究结果表明，随着年龄的增长，脑内SVZ和SGZ神经前体细胞增殖分化能力是减弱的[11，12] 。但有关脑生发区神经发生及脑老化与GDNF、GFR.α 1 表达的增龄性变化之间的关系还知之甚少。本研究结果显示，GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA的表达水平在出生后随年龄的增加而降低，具有增龄性变化，说明GDNF的变化可能影响神经前体细胞的发育、分化及随年龄增加而产生的脑老化过程，提示相关生发脑区的微环境在神经发生及脑老化过程中起着重要作用，同时也为GDNF用于治疗神经变性疾病提供了相关理论依据。
本实验结果显示，大鼠海马与SVZ的GFR.α 1 mR-NA在胚胎期与新生鼠呈高表达，出生后至1月龄明显下降，从3月龄起下降开始减缓;而GDNF mRNA则在新生鼠呈高表达，出生后开始下降;在12月龄组，海马与SVZ的GDNFmRNA、GFR.α 1 mRNA只有很少量的表达或无表达。这说明高表达的GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA不但在胚胎期及出生后早期的神经发育、分化中发挥着很重要的作用，而且其在成年期大鼠神经组织中一定水平的表达可能与神经组织的修复以及SVZ、海马维持正常功能有关。
Golden等用分子杂交的方法没有发现胚胎18d的小鼠海马GDNF mRNA的表达[13] 。但本实验发现，在胚胎18d的大鼠海马有很少量GDNF mRNA的表达，这说明GDNFmRNA的表达可能有种属差异。新生大鼠海马GDNF mRNA的表达明显升高，至生后下降。由于SGZ主要参与新生神经元的形成，并迁移整合到颗粒细胞层的神经环路中，在学习、记忆中发挥作用，这是否说明大鼠海马中与学习、记忆有关的神经元发育关键阶段是在出生及出生后一段时间内，而此时高表达的GDNF正是参与这些神经元的发育与成熟的重要因子?尚需要进一步的实验来证实。另外胚胎18d大鼠海马GDNFmRNA的表达与受体GFR.α 1 mRNA的表达发生了分离现象，这是否说明在GDNF mRNA表达很少的情况下受体反应性增加以增强GDNF的神经发育、分化作用?或者是胚胎脑其他部位表达的GD-NF作用于海马发挥其营养作用，也有待进一步的探讨。
实验中作者还发现，大鼠海马总RNA得率要少于SVZ，且各年龄组海马的GDNF mRNA、GFR.α 1 mRNA表达水平普遍低于SVZ。有关报道也显示，随年龄变化，SGZ的BrdU标记细胞数的减少较SVZ更为显著[11] 。这说明随着年龄的增加神经组织的自我修复能力是下降的，并且SGZ的修复能力要弱于SVZ。这些结果都为衰老时学习记忆减退作为较早出现的神经功能紊乱现象提供相关的理论依据，同时也说明GD-NF不但与神经发育、分化有关，也可能影响SGZ的神经环路的形成从而与脑老化过程相关。
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[基金项目] 江苏省自然科学基金资助项目(BK2002056)。
(东南大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，江苏南京 210009;江苏省人民医院病理科，江苏南京 210029;中山大学第二附属医院林百欣实验中心，广东广州 510120), http://www.100md.com(刘方舟，杨宁，朱岩，曾水林，潘秋辉，刘云龙)