ELISA反应板微孔空白吸光度一致性观察
随着抗体纯化、酶标记和比色技术的发展，在此基础上建立起来的酶联免疫吸附试验(ELISA)，因其具有快速、准确、灵敏、特异、简便等优点[1]，现已广泛地应用于病原生物特异性抗原、半抗原及相应的抗体、组织抗原、肿瘤相关抗原、激素等物质的测定[2]。已迅速地在临床实验室开展起来，愈来愈受到人们的重视。此项技术不仅可用于定性检验，借助酶标仪还可以做定量测定，极大地扩展了该技术的应用范围。影响酶联免疫吸附试验检测结果因素甚多[3]，本文随机测定了几个厂家生产的某批号部分反应板微孔的吸光度，对其一致性进行比较，探讨反应板微孔空白吸光度对检测结果的影响，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 酶标仪 河南省郑州博赛公司Biocell2010型。
1.1.2 微量移液器 上海求精生化试剂仪器有限公司生产。
1.1.3 微量反应板 甲型肝炎抗体(IgM)试剂盒(河南省洛阳市华美生物工程公司生产)；乙型肝炎表面抗体试剂盒(上海科华生物技术有限公司生产)；人类免疫缺陷病毒抗体试剂盒(广东省深圳市华康生物医学工程有限公司生产)；癌胚抗原测定试剂盒(河南省郑州博赛生物技术研究所生产)；前列腺特异性抗原测定试剂盒(河南省郑州安图生物工程有限公司生产)；弓形虫抗体IgG、IgM测定试剂盒(浙江省医学科学院生产)。
1.2 检测方法 自冰箱(4℃内)取出试剂盒微量反应板后，放入合适的反应架中，置室温平衡30min。用酶标仪按常规条件比色，读取各微孔吸光度。对均一性较差，检测结果可造成影响的两组微量反应板，加入已制备好的终止酶联反应液150μl(制备方法：适量的酶标记物，加入A、B两种显色液，显色后按比例加入终止液，使150μl液体在反应板微孔中的吸光度为1.000左右)，按常规条件进行比色，读取吸光度。
2 检测结果
(1)利用单波长(测量波长为450nm)对空白反应板微孔进行比色，结果见表1。(2)利用双波长(测量波长450nm、参考波长620nm)，对空白反应板微孔进行比色，结果见表2。将空白吸光度较高的两个厂家生产的微量反应板，每孔中准确加入已制备好的酶联反应终止液150μl，利用双波长(测量波长450nm、参考波长620nm)进行比色，结果见表3。
表1 -表3 (略)
3 讨论
酶联免疫吸附试验已广泛地被临床采用，其定性结果是以测定孔吸光度/阴性对照光度比值≥2.1为阳性，或根据测定吸光度与cutoff值比值计算结果，而定量检测是根据测定孔吸光度与校正曲线比较，计算出测定结果。每一个反应板微孔不仅是酶联免疫反应(抗原—抗体反应、酶促反应)池，还是一个比色池，所以每一个反应板微孔质量和整批反应板微孔吸光度均一性直接影响到检测结果的准确性。本组资料随机检测了几个厂家某批次部分反应板微孔吸光度，结果不尽如人意。表2结果显示，A、B、C、D、E等五家生产的反应板微孔空白吸光度均一性相对误差较大(C.V为27.5%~105.8%)，最大相差达8倍，但是其绝对值很小(最大为0.015)，对定性检验(阴性对照以0.05计算)和定量检测的结果影响很小，可忽略不计；而F、G两厂家生产的反应板微孔空白吸光度相对误差较大(C.V为30.0%~36.5%)，最大相差3.57倍，而绝对值较大(最大为0.025)，这样的反应板对检测结果(无论是定性，还是定量)的影响是肯定的。
表1、表2结果还显示，用双波长比色(测量波长450nm，参考波长620nm)，测定反应板微孔吸光度值较小，而用单波长比色(测量波长450nm)测定反应板微孔吸光度值较大，两者比较差异有显著性[以A厂家生产反应板为例：(0.00258±0.002)/(0.034±0.092)，n=24，t=16.006，t>t(n’)0.001，P<0.001]，说明双波长比色较单波长比色能降低反应板微孔的吸光度，提高检测结果的准确性。
表3结果显示，由于F、G两厂家生产的反应板微孔间均一性较差，吸光度变化较大，对处于临界值结果的样本有明显的影响，甚至造成假阳性或假阴性，在工作中应引起注意。
实验中发现，检测B厂家生产的微量反应板时，有一孔吸光度值显著高于其他孔(达到0.015)，仔细观察后，发现孔底有类似指纹样印迹，是否仅由此引起，尚待进一步观察，但是孔底和印迹对测定结果的影响是无疑的，提示在日常工作中应避免发生类似情况，应妥善保管、正确使用微量反应板。本组实验结果显示，监测空白反应板微孔吸光度，观察其一致性，可作为衡量试剂盒质量的又一佐证指标或在每次实验前，监测反应板微孔吸光度，剔除偏差较大的微孔，对提高检验结果的准确性有一定意义。
【参考文献】
1 龚非力.医学免疫学.北京：人民卫生出版社，2001，189-190.
2 周剑涛，姚正国，吴有才，等.基层医院实用临床检验方法.武汉：湖北科学技术出版社，2003，247-325.
3 陶义训，章谷生，孙荫.临床免疫检验.上海：上海科学技术出版社，1996，119-129.
作者单位：1 438800 湖北团风，团风县医院检验科
2 438000 湖北黄冈，黄冈市一医院检验科
(编辑：乔 晓), 百拇医药(金正国 汪宏)
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 酶标仪 河南省郑州博赛公司Biocell2010型。
1.1.2 微量移液器 上海求精生化试剂仪器有限公司生产。
1.1.3 微量反应板 甲型肝炎抗体(IgM)试剂盒(河南省洛阳市华美生物工程公司生产)；乙型肝炎表面抗体试剂盒(上海科华生物技术有限公司生产)；人类免疫缺陷病毒抗体试剂盒(广东省深圳市华康生物医学工程有限公司生产)；癌胚抗原测定试剂盒(河南省郑州博赛生物技术研究所生产)；前列腺特异性抗原测定试剂盒(河南省郑州安图生物工程有限公司生产)；弓形虫抗体IgG、IgM测定试剂盒(浙江省医学科学院生产)。
1.2 检测方法 自冰箱(4℃内)取出试剂盒微量反应板后，放入合适的反应架中，置室温平衡30min。用酶标仪按常规条件比色，读取各微孔吸光度。对均一性较差，检测结果可造成影响的两组微量反应板，加入已制备好的终止酶联反应液150μl(制备方法：适量的酶标记物，加入A、B两种显色液，显色后按比例加入终止液，使150μl液体在反应板微孔中的吸光度为1.000左右)，按常规条件进行比色，读取吸光度。
2 检测结果
(1)利用单波长(测量波长为450nm)对空白反应板微孔进行比色，结果见表1。(2)利用双波长(测量波长450nm、参考波长620nm)，对空白反应板微孔进行比色，结果见表2。将空白吸光度较高的两个厂家生产的微量反应板，每孔中准确加入已制备好的酶联反应终止液150μl，利用双波长(测量波长450nm、参考波长620nm)进行比色，结果见表3。
表1 -表3 (略)
3 讨论
酶联免疫吸附试验已广泛地被临床采用，其定性结果是以测定孔吸光度/阴性对照光度比值≥2.1为阳性，或根据测定吸光度与cutoff值比值计算结果，而定量检测是根据测定孔吸光度与校正曲线比较，计算出测定结果。每一个反应板微孔不仅是酶联免疫反应(抗原—抗体反应、酶促反应)池，还是一个比色池，所以每一个反应板微孔质量和整批反应板微孔吸光度均一性直接影响到检测结果的准确性。本组资料随机检测了几个厂家某批次部分反应板微孔吸光度，结果不尽如人意。表2结果显示，A、B、C、D、E等五家生产的反应板微孔空白吸光度均一性相对误差较大(C.V为27.5%~105.8%)，最大相差达8倍，但是其绝对值很小(最大为0.015)，对定性检验(阴性对照以0.05计算)和定量检测的结果影响很小，可忽略不计；而F、G两厂家生产的反应板微孔空白吸光度相对误差较大(C.V为30.0%~36.5%)，最大相差3.57倍，而绝对值较大(最大为0.025)，这样的反应板对检测结果(无论是定性，还是定量)的影响是肯定的。
表1、表2结果还显示，用双波长比色(测量波长450nm，参考波长620nm)，测定反应板微孔吸光度值较小，而用单波长比色(测量波长450nm)测定反应板微孔吸光度值较大，两者比较差异有显著性[以A厂家生产反应板为例：(0.00258±0.002)/(0.034±0.092)，n=24，t=16.006，t>t(n’)0.001，P<0.001]，说明双波长比色较单波长比色能降低反应板微孔的吸光度，提高检测结果的准确性。
表3结果显示，由于F、G两厂家生产的反应板微孔间均一性较差，吸光度变化较大，对处于临界值结果的样本有明显的影响，甚至造成假阳性或假阴性，在工作中应引起注意。
实验中发现，检测B厂家生产的微量反应板时，有一孔吸光度值显著高于其他孔(达到0.015)，仔细观察后，发现孔底有类似指纹样印迹，是否仅由此引起，尚待进一步观察，但是孔底和印迹对测定结果的影响是无疑的，提示在日常工作中应避免发生类似情况，应妥善保管、正确使用微量反应板。本组实验结果显示，监测空白反应板微孔吸光度，观察其一致性，可作为衡量试剂盒质量的又一佐证指标或在每次实验前，监测反应板微孔吸光度，剔除偏差较大的微孔，对提高检验结果的准确性有一定意义。
【参考文献】
1 龚非力.医学免疫学.北京：人民卫生出版社，2001，189-190.
2 周剑涛，姚正国，吴有才，等.基层医院实用临床检验方法.武汉：湖北科学技术出版社，2003，247-325.
3 陶义训，章谷生，孙荫.临床免疫检验.上海：上海科学技术出版社，1996，119-129.
作者单位：1 438800 湖北团风，团风县医院检验科
2 438000 湖北黄冈，黄冈市一医院检验科
(编辑：乔 晓), 百拇医药(金正国 汪宏)