人截短型凋亡诱导因子AIF△1480的表达对HeLa细胞的促凋亡作用
Ext.14Email.liuxiangli2002@126.comEffect of truncated human apoptosisinducing factor expression on apoptosis of HeLa cells
LIU XiangLi1，YU CuiJuan2，XU YanMing1，ZHAO Jing1，WANG ChengJi1，YANG AnGang1，2
1Department of Biochemistry ＆ Molecular Biology， 2Department of Immunology，School of Basic Medicine,Fourth Military
Medical University，Xian 710033，China
【Abstract】 AIM: To observe the expression of the truncated human apoptosisinducing factor (AIF) gene and its apoptosisinducing effect on HeLa cells.METHODS: After the truncated human apoptosisinducing factor (AIF△1120) gene was successfully cloned,the shorter truncated human AIF gene (AIF△1480) was cloned,which was constructed by deleting the Nterminal mitochondrial location sequence (MLS) and the coding sequence of flavin adenine dinucleotide (FAD) binding domain and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) binding domain of AIF protein.The truncated human AIF gene(AIF△1480) was inserted into the EGFP coexpression vector pIRES2EGFP,and the pIRES2EGFPAIF△1480 was then transfected into HeLa cells with LipofectAMINE.The expression of the truncated AIF gene and its effect on HeLa cell were detected by fluorescence microscope and electron microscope analysis.RESULTS: The eukaryotic expression vector pIRES2EGFP containing the truncated human AIF(AIF△1480)gene was successfully constructed.The AIF protein could be detected in the transfected HeLa cells.After transfection,typical apoptotic changes of the transfected HeLa cells and a mass of cell death were observed under electron microscope.CONCLUSION: The expression of the truncated human AIF(AIF△1480)gene can induce apoptosis of the transfected human HeLa cells.
【Keywords】 apoptosisinducing factor；HeLa cells；apoptosis
【摘要】 目的： 观察人截短型AIF(AIF△1480)基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用. 方法： 在人截短型AIF(AIF△1120)基因克隆成功的基础上，进一步改造，构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域(1480位氨基酸)编码序列的人截短型AIF(AIF△1480)基因.将其克隆入pIRES2EGFP绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察、电镜观察等方法，检测目的基因在转染细胞中的表达以及对转染细胞形态的影响.结果： 成功构建了人截短型AIF(AIF△1480)基因的真核表达载体.转染细胞后，可检测到人截短型AIF(AIF△1480)分子的表达.转染后48 h，可观察到表达人截短型AIF(AIF△1480)分子的细胞呈现典型的凋亡特征.结论： 人截短型AIF(AIF△1480)基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡.
【关键词】 凋亡诱导因子；HeLa细胞；细胞凋亡
0引言
凋亡诱导因子(apoptosisinducing factor，AIF)是1996年发现的一种凋亡诱导蛋白，成熟的AIF分子全长559个氨基酸，在细胞中表达后定位于线粒体膜间隙中[1].当凋亡信号刺激时，可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接介导细胞核发生凋亡[2-4].有研究表明AIF介导的细胞凋亡在胚胎形成时期起重要作用[5].体外实验证明，显微注射AIF分子能引起分离的细胞核中部分DNA丢失，染色体周边凝集和DNA呈大片段断裂(~50 kb).这些作用不受广谱caspases抑制剂zVAD.fmk的抑制，也不受Bcl2过量表达的影响[1]，代表着独立于caspase信号通路之外的另一条凋亡途径[5].
成熟的AIF分子由3部分构成： 1个FAD结合结构域(122262 aa和400477 aa)，1个NADH结合结构域(263399 aa)和1个C末端结构域(478610 aa).鉴于AIF在细胞凋亡中具有的独特功能，我们拟进一步探索其在基因治疗中应用的可能性.在以前成功克隆人截短型AIF(AIF△1120)基因的基础[6]上，我们对AIF基因的结构[7]进行了改造，去除其FAD结合结构域和NADH结合结构域(1480位氨基酸)编码序列，构建了仅保留AIF分子C末端的人截短型AIF(AIF△1480)基因，观察了其在HeLa细胞中的表达及其促凋亡活性，为实际应用奠定了基础.
1材料和方法
1.1材料pcDNA3AIF△1120质粒由第四军医大学免疫学教研室于翠娟博士构建.Ecoli DH5α菌种、人HeLa细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存.载体pIRES2EGFP购自Clontech公司.Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自TakaRa公司.新生牛血清购自杭州四季青生物公司.RPMI1640及脂质体LipofectAMINETM2000为Invitrogen公司产品.
1.2方法
1.2.1人截短型AIF基因(AIF△1480)的克隆以pcDNA3AIF△1120质粒为模板，用引物Pa4(5′TTTGGTACCGAATTCCACCATGTTCTGGAGTGATTTGGGC3′)和引物Ya6 (5′TTTTCTAGAGTCGACTCAGTCTTCATGAATGTTGAATAG3′)进行PCR，扩增出AIF基因480位氨基酸密码子以后的片段，命名为AIF△1480.
1.2.2人截短型AIF基因(AIF△1480)真核表达载体的构建将PCR扩增出的AIF△1480基因片段，经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，克隆入pIRES2EGFP载体的相应位点，并转化E.coliDH5α菌株，挑阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定，并交由上海鼎安公司测序，将构建成功的质粒命名为pIRES2EGFPAIF△1480.
1.2.3细胞转染于转染前24 h，用胰酶消化生长至对数期的HeLa细胞，加至12孔板的玻片上，制成细胞爬片.待细胞达80%汇合率时进行转染.爬片细胞先用无血清RPMI1640洗2次，加08 mL无血清RPMI 1640.将2 μg质粒DNA和4 μL LipofectAMINETM2000分别加于100 μL无血清RPMI1640中，轻轻振摇5 min，混匀，制成转染液，室温静置20 min后，将转染液逐滴加入爬片细胞中，轻轻混合，置37℃孵育6 h，弃去转染液，加含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640继续培养.
1.2.4荧光显微镜观察将HeLa细胞加至12孔板的玻片上，用脂质体法转染pIRES2EGFPAIF△1480，于转染后24，48，72 h，取出爬片，用40 g/L多聚甲醛固定后，置于荧光显微镜下观察细胞形态.对照组细胞转染pIRES2EGFP空载体，处理方法与实验组相同.
1.2.5电镜标本制作及观察将HeLa细胞接种于6孔板中，以脂质体法转染pIRES2EGFPAIF△1480，于转染后48 h，用胰酶消化细胞，离心收集细胞，用PBS洗2次，25 g/L戊二醛4℃固定2 h，剥离细胞团块，脱水包埋，制备超薄切片、染色、水洗，用透射电镜观察并照相.
2结果
2.1人截短型AIF基因(AIF△1480)的克隆及鉴定 以pcDNA3AIF△1120质粒为模板，用引物Pa4和Ya6进行PCR，扩增出约402 bp的AIF△1480基因片段(Fig 1).将此片段克隆入pIRES2EGFP载体的相应位点，经双酶切鉴定(Fig 2)后测序，与GenBank中AIF基因的序列相比较，证实我们所获序列完全正确.命名为pIRES2EGFP AIF△1480.
图1PCR扩增的人截短型AIF基因(AIF△1480)的琼脂糖凝胶电泳分析 (略)
图2pIRES2EGFP AIF△1480的酶切鉴定 (略)
2.2AIF△1480基因在HeLa细胞中的表达分别取目的基因转染后24,48,72 h的HeLa细胞，进行荧光显微镜观察.转染空载体的细胞生长状况良好；实验组细胞则有细胞膜出泡，细胞核不均一等形态学变化.随着转染后时间的延长，转染细胞数减少，荧光强度变弱，许多细胞已不具有清晰的轮廓；部分细胞体积增大变圆，出现多核现象；另一部分细胞成固缩状，提示细胞已经死亡(Fig 3).A： Cells transfected with pIRES2EGFP; B，C， D： Cells at 24 h，48 h，and 72 h after being transfected with pIRES2EGFP AIF△1480.
图3人AIF△1480在HeLa细胞中的表达及转染不同时间后的HeLa细胞形态变化 (略)
2.3人AIF△1480基因表达对HeLa细胞结构的影响电子显微镜观察表明，与转染空载体pIRES2EGFP组的细胞相比较，实验组中人AIF△1480基因的表达可使HeLa细胞出现典型的凋亡细胞特征： 如细胞膜表面微绒毛消失，核膜及细胞膜完整，细胞膜表面出泡，染色体凝集且聚集于核膜周边(Fig 4).A： HeLa cells transfected with pIRES2EGFP vector ×3000； B： HeLa cells transfected with pIRES2EGFPAIF△1480×7500
图4人AIF△1480基因转染的HeLa细胞形态变化的电镜观察 (略)
3讨论
细胞凋亡是所有多细胞生物所具有的一种基本特征，有重要的生理意义.目前普遍认为，caspases是介导细胞凋亡的主要分子，但是在大部分应激诱导的哺乳动物凋亡模型中，caspases的抑制剂并不能完全阻止细胞凋亡的发生[8-10].近年来发现，有独立于caspases信号通路之外的另一条凋亡途径存在，即存在由AIF直接介导的细胞凋亡途径[4，5，11，12].AIF在多种组织中广泛分布，其基因定位于X染色体上.AIF前体蛋白在细胞内合成后，通过其N末端的线粒体定位信号(MLS)可有效地穿入线粒体膜间隙，然后在102位甘氨酸处水解掉MLS，其余部分再与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合，并重新折叠为具有促凋亡潜能的成熟AIF分子.当凋亡信号刺激时，可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接介导早期凋亡核的形态变化，包括大片段DNA断裂的产生和初期的外周染色体凝集[1].基因敲除实验发现，AIF/γ小鼠胚胎期可致死.在进一步体外模拟哺乳动物早期胚胎发生过程中发现，AIF的促凋亡活性是小鼠形态发生过程中胚体腔形成所必需的[5].而且该过程是AIF独立作用的结果.
我们在成功构建人截短型AIF(AIF△1120)基因的基础上，用PCR的方法扩增出了更短的人截短型AIF(AIF△1480)基因，用酶切连接等得到截短型AIF(AIF△1480)基因的真核表达载体，以脂质体法转染HeLa细胞.
将截短型AIF(AIF△1480)基因克隆入pIRES2EGFP绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体，可使GFP绿色荧光蛋白和AIF基因同时表达.荧光显微镜观察显示，转染后24 h可观察到绿色荧光，即有截短型AIF(AIF△1480)基因的表达.转染后48 h，细胞呈现细胞膜出泡及细胞质、核固缩等形态变化.进一步电镜观察呈现凋亡细胞的超微结构，结果显示转染截短型AIF(AIF△1480)基因后48 h时，有些细胞已经表现出明显的凋亡特征，可观察到染色体大块凝集及凋亡小体形成.事实上，很多研究在检测到AIF从线粒体转位到细胞核内时，就认为该细胞正在发生凋亡或凋亡的发生不可避免.
AIF的致凋亡作用不受caspases的抑制剂(如zVAD.fmk，IAP等)的抑制，也不受上游凋亡信号的控制，具有作为肿瘤杀伤分子特殊的优越性.我们对AIF基因进行了改造，克隆了人截短型AIF(AIF△1480)基因，证实了人AIF基因去除线粒体定位信号，FAD结合结构域和NADH结合结构域后仍具有促凋亡活性.和AIF基因相比，这种截短型AIF基因由于具有分子小的特征，更有利于应用，为将其用于肿瘤杀伤和基因治疗奠定了基础.
【参考文献】
[1] Susin SA， Lorenao HK， Zamzami N，et al.Molecular characterization of mitochondrial apoptosisinducing factor[J].Nature，1999；397(6718)：441-446.
[2] Daugus E，Susin SA，Zamzami N，et al.Mitochondrionuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis[J].FASEB J，2000；14(5)：729-739.
[3] Leoffler M，Daugus E，Susin SA，et al.Dominant cell death induction by extramitochondrially targeted apoptosisinducing factor[J].FASEB J，2001；15(3)：758-767.
[4] Susin SA，Daugus E，Ravagnan L，et al.Two distinct pathways leading to nuclearapoptosis[J].J Exp Med，2000；192(4)：571-579.
[5] Joza N，Susin SA，Daugus E，et al.Essential role of the mitochondrial apoptosisinducing factor in programmed cell death[J].Nature，2002；410(6828)：549-554.
[6] 于翠娟，孟艳玲，桂俊豪，等.重组人凋亡诱导因子基因的构建、表达及对HeLa细胞的促凋亡作用[J].生物化学与生物物理学进展，2002；29(6)：915-921.
Yu CJ，Meng YL，Gui JH，et al.Gene construction，expression and the apoptosis inducing effects on cells of the recombinant apoptosis inducing factor[J].J Prog Biochem Biophys，2002；29(6)：915-921.
[7] Mate MJ，OrtizLombandia M，Boitel B，et al.The crystal structure of the mouse apoptosisinducing factor AIF[J].Nat Struct Biol，2002；9(6)：442-446.
[8] Mc Cathy NJ，Whyle MKB，Gilbert CS，et al.Inhibition of Ced3/ICErelated protease does not prevent cell death induced by oncogenes，DNA damage，or the Bcl2 homologue Bak[J].J Cell Biol，1997；136(1)：215-227.
[9] Deas O，Dumont C，Mac Farlane M，et al.Caspases independent cell death induced by antiCD2 or staurosporine in activated human peripheral T lymphocytes[J].J Immunol，1998；161(7)：3375-3383.
[10] Dong Z，Salkumar P，Griess GA，et al.Intracellular Ca2+ thresholds that determine survival or death of energy deprived cells[J].Am J Pathol，1998；152(1)：231-240.
[11] Lorenao HK，Susin SA，Penninger J，et al.Apoptosisinducing factor(AIF)： A phylogenetically old，caspaseindependent effector of cell death[J].J Cell Death Differ，1999；6(6)：516-524.
[12] Cande C，Cohen I，Daugus E，et al.Apoptosisinducing factor(AIF)： A novel caspase independent death effector released from mitochondrial[J].Biochimie，2002；84(2，3)：215-222.
第四军医大学基础部： 1生物化学与分子生物学教研室，2免疫学教研室，陕西 西安 710033
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39925036)；军队杰出中青年人才科研基金资助项目(98J009)；国家“863”计划资助项目(2004AA217071)
编辑许昌泰, 百拇医药(刘湘丽，于翠娟，许彦鸣，赵晶，王成济，杨安钢)
LIU XiangLi1，YU CuiJuan2，XU YanMing1，ZHAO Jing1，WANG ChengJi1，YANG AnGang1，2
1Department of Biochemistry ＆ Molecular Biology， 2Department of Immunology，School of Basic Medicine,Fourth Military
Medical University，Xian 710033，China
【Abstract】 AIM: To observe the expression of the truncated human apoptosisinducing factor (AIF) gene and its apoptosisinducing effect on HeLa cells.METHODS: After the truncated human apoptosisinducing factor (AIF△1120) gene was successfully cloned,the shorter truncated human AIF gene (AIF△1480) was cloned,which was constructed by deleting the Nterminal mitochondrial location sequence (MLS) and the coding sequence of flavin adenine dinucleotide (FAD) binding domain and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) binding domain of AIF protein.The truncated human AIF gene(AIF△1480) was inserted into the EGFP coexpression vector pIRES2EGFP,and the pIRES2EGFPAIF△1480 was then transfected into HeLa cells with LipofectAMINE.The expression of the truncated AIF gene and its effect on HeLa cell were detected by fluorescence microscope and electron microscope analysis.RESULTS: The eukaryotic expression vector pIRES2EGFP containing the truncated human AIF(AIF△1480)gene was successfully constructed.The AIF protein could be detected in the transfected HeLa cells.After transfection,typical apoptotic changes of the transfected HeLa cells and a mass of cell death were observed under electron microscope.CONCLUSION: The expression of the truncated human AIF(AIF△1480)gene can induce apoptosis of the transfected human HeLa cells.
【Keywords】 apoptosisinducing factor；HeLa cells；apoptosis
【摘要】 目的： 观察人截短型AIF(AIF△1480)基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用. 方法： 在人截短型AIF(AIF△1120)基因克隆成功的基础上，进一步改造，构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域(1480位氨基酸)编码序列的人截短型AIF(AIF△1480)基因.将其克隆入pIRES2EGFP绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察、电镜观察等方法，检测目的基因在转染细胞中的表达以及对转染细胞形态的影响.结果： 成功构建了人截短型AIF(AIF△1480)基因的真核表达载体.转染细胞后，可检测到人截短型AIF(AIF△1480)分子的表达.转染后48 h，可观察到表达人截短型AIF(AIF△1480)分子的细胞呈现典型的凋亡特征.结论： 人截短型AIF(AIF△1480)基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡.
【关键词】 凋亡诱导因子；HeLa细胞；细胞凋亡
0引言
凋亡诱导因子(apoptosisinducing factor，AIF)是1996年发现的一种凋亡诱导蛋白，成熟的AIF分子全长559个氨基酸，在细胞中表达后定位于线粒体膜间隙中[1].当凋亡信号刺激时，可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接介导细胞核发生凋亡[2-4].有研究表明AIF介导的细胞凋亡在胚胎形成时期起重要作用[5].体外实验证明，显微注射AIF分子能引起分离的细胞核中部分DNA丢失，染色体周边凝集和DNA呈大片段断裂(~50 kb).这些作用不受广谱caspases抑制剂zVAD.fmk的抑制，也不受Bcl2过量表达的影响[1]，代表着独立于caspase信号通路之外的另一条凋亡途径[5].
成熟的AIF分子由3部分构成： 1个FAD结合结构域(122262 aa和400477 aa)，1个NADH结合结构域(263399 aa)和1个C末端结构域(478610 aa).鉴于AIF在细胞凋亡中具有的独特功能，我们拟进一步探索其在基因治疗中应用的可能性.在以前成功克隆人截短型AIF(AIF△1120)基因的基础[6]上，我们对AIF基因的结构[7]进行了改造，去除其FAD结合结构域和NADH结合结构域(1480位氨基酸)编码序列，构建了仅保留AIF分子C末端的人截短型AIF(AIF△1480)基因，观察了其在HeLa细胞中的表达及其促凋亡活性，为实际应用奠定了基础.
1材料和方法
1.1材料pcDNA3AIF△1120质粒由第四军医大学免疫学教研室于翠娟博士构建.Ecoli DH5α菌种、人HeLa细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存.载体pIRES2EGFP购自Clontech公司.Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自TakaRa公司.新生牛血清购自杭州四季青生物公司.RPMI1640及脂质体LipofectAMINETM2000为Invitrogen公司产品.
1.2方法
1.2.1人截短型AIF基因(AIF△1480)的克隆以pcDNA3AIF△1120质粒为模板，用引物Pa4(5′TTTGGTACCGAATTCCACCATGTTCTGGAGTGATTTGGGC3′)和引物Ya6 (5′TTTTCTAGAGTCGACTCAGTCTTCATGAATGTTGAATAG3′)进行PCR，扩增出AIF基因480位氨基酸密码子以后的片段，命名为AIF△1480.
1.2.2人截短型AIF基因(AIF△1480)真核表达载体的构建将PCR扩增出的AIF△1480基因片段，经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，克隆入pIRES2EGFP载体的相应位点，并转化E.coliDH5α菌株，挑阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定，并交由上海鼎安公司测序，将构建成功的质粒命名为pIRES2EGFPAIF△1480.
1.2.3细胞转染于转染前24 h，用胰酶消化生长至对数期的HeLa细胞，加至12孔板的玻片上，制成细胞爬片.待细胞达80%汇合率时进行转染.爬片细胞先用无血清RPMI1640洗2次，加08 mL无血清RPMI 1640.将2 μg质粒DNA和4 μL LipofectAMINETM2000分别加于100 μL无血清RPMI1640中，轻轻振摇5 min，混匀，制成转染液，室温静置20 min后，将转染液逐滴加入爬片细胞中，轻轻混合，置37℃孵育6 h，弃去转染液，加含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640继续培养.
1.2.4荧光显微镜观察将HeLa细胞加至12孔板的玻片上，用脂质体法转染pIRES2EGFPAIF△1480，于转染后24，48，72 h，取出爬片，用40 g/L多聚甲醛固定后，置于荧光显微镜下观察细胞形态.对照组细胞转染pIRES2EGFP空载体，处理方法与实验组相同.
1.2.5电镜标本制作及观察将HeLa细胞接种于6孔板中，以脂质体法转染pIRES2EGFPAIF△1480，于转染后48 h，用胰酶消化细胞，离心收集细胞，用PBS洗2次，25 g/L戊二醛4℃固定2 h，剥离细胞团块，脱水包埋，制备超薄切片、染色、水洗，用透射电镜观察并照相.
2结果
2.1人截短型AIF基因(AIF△1480)的克隆及鉴定 以pcDNA3AIF△1120质粒为模板，用引物Pa4和Ya6进行PCR，扩增出约402 bp的AIF△1480基因片段(Fig 1).将此片段克隆入pIRES2EGFP载体的相应位点，经双酶切鉴定(Fig 2)后测序，与GenBank中AIF基因的序列相比较，证实我们所获序列完全正确.命名为pIRES2EGFP AIF△1480.
图1PCR扩增的人截短型AIF基因(AIF△1480)的琼脂糖凝胶电泳分析 (略)
图2pIRES2EGFP AIF△1480的酶切鉴定 (略)
2.2AIF△1480基因在HeLa细胞中的表达分别取目的基因转染后24,48,72 h的HeLa细胞，进行荧光显微镜观察.转染空载体的细胞生长状况良好；实验组细胞则有细胞膜出泡，细胞核不均一等形态学变化.随着转染后时间的延长，转染细胞数减少，荧光强度变弱，许多细胞已不具有清晰的轮廓；部分细胞体积增大变圆，出现多核现象；另一部分细胞成固缩状，提示细胞已经死亡(Fig 3).A： Cells transfected with pIRES2EGFP; B，C， D： Cells at 24 h，48 h，and 72 h after being transfected with pIRES2EGFP AIF△1480.
图3人AIF△1480在HeLa细胞中的表达及转染不同时间后的HeLa细胞形态变化 (略)
2.3人AIF△1480基因表达对HeLa细胞结构的影响电子显微镜观察表明，与转染空载体pIRES2EGFP组的细胞相比较，实验组中人AIF△1480基因的表达可使HeLa细胞出现典型的凋亡细胞特征： 如细胞膜表面微绒毛消失，核膜及细胞膜完整，细胞膜表面出泡，染色体凝集且聚集于核膜周边(Fig 4).A： HeLa cells transfected with pIRES2EGFP vector ×3000； B： HeLa cells transfected with pIRES2EGFPAIF△1480×7500
图4人AIF△1480基因转染的HeLa细胞形态变化的电镜观察 (略)
3讨论
细胞凋亡是所有多细胞生物所具有的一种基本特征，有重要的生理意义.目前普遍认为，caspases是介导细胞凋亡的主要分子，但是在大部分应激诱导的哺乳动物凋亡模型中，caspases的抑制剂并不能完全阻止细胞凋亡的发生[8-10].近年来发现，有独立于caspases信号通路之外的另一条凋亡途径存在，即存在由AIF直接介导的细胞凋亡途径[4，5，11，12].AIF在多种组织中广泛分布，其基因定位于X染色体上.AIF前体蛋白在细胞内合成后，通过其N末端的线粒体定位信号(MLS)可有效地穿入线粒体膜间隙，然后在102位甘氨酸处水解掉MLS，其余部分再与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合，并重新折叠为具有促凋亡潜能的成熟AIF分子.当凋亡信号刺激时，可检测到AIF分子从线粒体释放到细胞质，然后转位到细胞核内，直接介导早期凋亡核的形态变化，包括大片段DNA断裂的产生和初期的外周染色体凝集[1].基因敲除实验发现，AIF/γ小鼠胚胎期可致死.在进一步体外模拟哺乳动物早期胚胎发生过程中发现，AIF的促凋亡活性是小鼠形态发生过程中胚体腔形成所必需的[5].而且该过程是AIF独立作用的结果.
我们在成功构建人截短型AIF(AIF△1120)基因的基础上，用PCR的方法扩增出了更短的人截短型AIF(AIF△1480)基因，用酶切连接等得到截短型AIF(AIF△1480)基因的真核表达载体，以脂质体法转染HeLa细胞.
将截短型AIF(AIF△1480)基因克隆入pIRES2EGFP绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体，可使GFP绿色荧光蛋白和AIF基因同时表达.荧光显微镜观察显示，转染后24 h可观察到绿色荧光，即有截短型AIF(AIF△1480)基因的表达.转染后48 h，细胞呈现细胞膜出泡及细胞质、核固缩等形态变化.进一步电镜观察呈现凋亡细胞的超微结构，结果显示转染截短型AIF(AIF△1480)基因后48 h时，有些细胞已经表现出明显的凋亡特征，可观察到染色体大块凝集及凋亡小体形成.事实上，很多研究在检测到AIF从线粒体转位到细胞核内时，就认为该细胞正在发生凋亡或凋亡的发生不可避免.
AIF的致凋亡作用不受caspases的抑制剂(如zVAD.fmk，IAP等)的抑制，也不受上游凋亡信号的控制，具有作为肿瘤杀伤分子特殊的优越性.我们对AIF基因进行了改造，克隆了人截短型AIF(AIF△1480)基因，证实了人AIF基因去除线粒体定位信号，FAD结合结构域和NADH结合结构域后仍具有促凋亡活性.和AIF基因相比，这种截短型AIF基因由于具有分子小的特征，更有利于应用，为将其用于肿瘤杀伤和基因治疗奠定了基础.
【参考文献】
[1] Susin SA， Lorenao HK， Zamzami N，et al.Molecular characterization of mitochondrial apoptosisinducing factor[J].Nature，1999；397(6718)：441-446.
[2] Daugus E，Susin SA，Zamzami N，et al.Mitochondrionuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis[J].FASEB J，2000；14(5)：729-739.
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第四军医大学基础部： 1生物化学与分子生物学教研室，2免疫学教研室，陕西 西安 710033
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(39925036)；军队杰出中青年人才科研基金资助项目(98J009)；国家“863”计划资助项目(2004AA217071)
编辑许昌泰, 百拇医药(刘湘丽，于翠娟，许彦鸣，赵晶，王成济，杨安钢)