青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序
摘要：【目的】克隆青蒿鲨烯合酶基因，为基因工程改造青蒿打下基础。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)扩增、 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增、扩增片段与T载体连接和克隆片段的序列分析等方法。【结果】 通过PCR扩增和RTPCR扩增，分别获得3?590?bp及1?257?bp片段，克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果与GenBank上已登录的青蒿鲨烯合酶基因序列同源性为99%，氨基酸序列同源性为100%。【结论】成功克隆了青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA。
关键词：青蒿； 鲨烯合酶基因； DNA，重组； 序列分析，DNA
青蒿素是我国自主研发的抗疟原虫中药有效单体，对氯奎抗性疟原虫有效，现已成为全球抗疟药的希望。 青蒿素是青蒿经类异戊二烯次生代谢途径所形成的倍半萜衍生物。利用基因工程对青蒿进行基因敲变(knockdown)或敲除(knockout)已成为青蒿遗传改良的两大方向。为了研究在青蒿内导入鲨烯合酶基因反义序列，抑制鲨烯合酶基因表达或除去鲨烯合酶基因使青蒿素合成增加的可能性，我们克隆了青蒿鲨烯合酶基因，并经测序予以证实，为下一步培育转基因高产青蒿植株打下了基础。
1 材料
11 青蒿(Artemisia annua L.) 采自我国海南省三亚市(由四川引种)。
12 试剂 植物DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.Plant DNA Kit)、植物RNA提取试剂盒(E.Z.N.A.Plant RNA Kit)均购自 Omega公司；质粒DNA纯化试剂盒(Concert Rapid Plasmid Miniprep System)、DNA片段回收试剂盒(Concert Rapid Gel Extraction System)均购自 Life Technologies 公司； 聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒 ( One Shot LA PCR Mix)及逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增试剂盒(mRNA Selective PCR Kit)均购自 Takara公司；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。
2 方法
21 DNA的提取 按植物DNA提取试剂盒说明书提取青蒿植株的DNA。
22 RNA的提取 按植物RNA提取试剂盒说明书提取青蒿植株的总RNA。
23 引物设计 按GenBank AF405310、AF302464设计引物(SSPri5:5ATGAGTAGTTTGAAAGCAGTATTGAAACAC3；SSPri3:5TTACAAAGTGAATTTCTGCAGAGAGTAAGCA3；SSRNA:5TTACAAAGTGAATTTGATTTTATTGG3)，委托Takara公司合成。
24 PCR 扩增 以提取的青蒿DNA为模板，SSPri5、SSPri3为上下游引物，用Takara公司的One Shot LA PCR Mix扩增，扩增条件为： 94℃，1?min→94℃，30s，57℃，1min，72℃，5?min，30个循环→72℃，10?min→4℃。
25 RTPCR扩增 以提取的青蒿RNA为模板，SSPri5、SSRNA为上下游引物，用Takara公司的mRNA Selective PCR Kit扩增，扩增条件为： 50℃，30?s→85℃，1?min，50℃，1?min，72℃，5min，30个循环→72℃，10?min→4℃。
26 构建重组质粒 将PCR产物及RTPCR产物分别与pTarge T载体(Promega公司)连接，转化DH5α感受态细胞，涂板，蓝白斑筛选重组子。
27 重组质粒的鉴定及测序 用Life Technologies公司的试剂盒提取质粒，分别经PCR扩增和EcoRⅠ酶切进行鉴定。PCR扩增采用Promega公司的Tf1酶，反应条件为：94℃，1?min→94℃，30s，57℃，1min，72℃，5?min，30个循环→72℃，10?min→4℃。最后在 ABI Prism 310 DNA测序仪上用T7启动子引物测序。
3 结果
31 鲨烯合酶互补DNA(cDNA)扩增 青蒿植株RNA经RTPCR扩增和10?g/L凝胶电泳后，可检测到长度约为1?300?bp的DNA区带(见图1)。
32 鲨烯合酶基因扩增 青蒿植株DNA经PCR扩增和10?g/L凝胶电泳后，可检测到长度约为3?600?bp的DNA区带(见图2)。
33 鲨烯合酶基因克隆和鉴定 将扩增片段插入pTarge T载体后，获得重组质粒pTSSD。对 pTSSD 进行PCR扩增，经10?g/L凝胶电泳检测，可见与青蒿植株DNA的PCR产物大小相当的区带，表明上述扩增片段已与载体连接。将重组质粒用EcoRⅠ酶切，经10?g/L凝胶电泳后，可见一条略比青蒿植株DNA的PCR产物大的基因区带和另一条载体带(见图3)。
按实验设计，鲨烯合酶基因扩增片段的理论长度应为3?590?bp，插入T载体(5?670?bp)并用EcoRI酶切后，含有鲨烯合酶基因的酶切片段中尚包括68?bp载体片段，其实际长度应为3?658?bp。实验结果与此分析相符，初步表明青蒿鲨烯合酶基因已被克隆。
34 鲨烯合酶cDNA克隆和鉴定 将扩增片段插入pTarge T载体后获得重组质粒pTSSR。对pTSSR进行PCR扩增，经10?g/L凝胶电泳后检测到与青蒿植株RNA的RTPCR产物大小相当的区带，表明上述扩增片段已与载体连接。将重组质粒用EcoRⅠ酶切，经10?g/L凝胶电泳后，可见一条略比青蒿植株RNA的RTPCR产物大的基因区带和另一条载体带(见图4)。
按实验设计，鲨烯合酶cDNA 扩增片段的理论长度应为1?257?bp，插入T载体(5?670?bp)并用EcoRⅠ酶切后，含有鲨烯合酶cDNA 的酶切片段中包括68bp载体片段，其实际长度应为1?325?bp。实验结果与此分析相符，初步表明鲨烯合酶cDNA已被克隆。
35 鲨烯合酶基因及其cDNA序列分析
对上述两种重组质粒中的插入片段进行序列分析，结果显示pTSSD的插入片段为3?590?bp，pTSSR的插入片段为1?258?bp。经与GenBank中所发表的序列比较，显示两者都含有13个内含子，但序列之间存在某些碱基对的差别，推测这些差异可能源于单核苷酸多态性(SNP)。
鲨烯合酶基因及cDNA序列已被Genbank收录，编号分别为AY445505和AY445506。
测序结果与GenBank上已登录的青蒿鲨烯合酶基因序列同源性为99%，氨基酸序列同源性为100%。
1.λDNA/EcoRI+HindIII Markers； 2-4.RTPCR产物；5.对照
图1 青蒿植株RNA的RTPCR扩增产物(略)
1.对照；2-4.PCR产物； 5.λDNA/EcoRI+HindIII Markers
图2 青蒿植株DNA的PCR扩增产物(略)
1.pTSSD的EcoRⅠ酶切产物；2.空白对照；3.青蒿植株DNA的PCR产物； 4.λDNA/HindIII Markers
图3 pTSSD的PCR鉴定及酶切鉴定(略)
1.λDNA/HindIII Markers；2.青蒿植株RNA的RTPCR产物；3.pTSSR的EcoRⅠ酶切产物
图4 pTSSR的PCR鉴定及酶切鉴定(略)
4 讨论
青蒿(Artemisia annua L.)在临床上用于治疗暑热外感、阴虚发热、湿热黄疸诸证，其功用在历代本草中均有丰富记载。作为世界卫生组织极力推崇的抗疟药有效成分—青蒿素，是我国科学工作者从青蒿中分离出的化学单体[1]。同时，青蒿素还具有免疫调节功能[2]；青蒿素衍生物青蒿琥酯钠有抗肿瘤作用[3]；青蒿甲醇提取物N1N5N10三p香豆酰精脒及相关酰胺类化合物能抑制艾滋病毒蛋白酶活性[4]。由于受品种、产地和气候条件的限制，青蒿素的产量远不能满足市场需求，而常规栽培育种方法在提高青蒿素产量中的作用十分有限。因此，采用基因工程手段培育高产青蒿素品种正在受到国内外学者的关注[56]。国内外陆续开展了青蒿素生物合成关键酶基因及其克隆的研究工作，已相继克隆出从乙酰CoA至法呢基焦磷酸合成途径中的3个关键酶基因，它们是3羟3甲基戊二酰CoA还原酶基因、法呢基焦磷酸合酶基因、倍半萜合酶基因。自1993年Paniego 等[7]首次用根癌农杆菌T37菌株诱导青蒿幼茎组织产生芽状畸胎瘤以来，青蒿遗传转化技术逐步建立，并且日趋成熟。由此可见，通过植物基因工程改良青蒿以提高青蒿素的产量是大有可为的。
青蒿素为倍半萜类化合物，系由类异戊二烯途径合成而来，其中甾类与倍半萜类的生物合成途径分别处在两条不同的岔路上。从类异戊二烯途径中碳源的流向来看，甾类作为主要代谢产物自然成为碳流的主导者，而倍半萜类作为次生代谢产物则只能分享少量碳流。因此，为了将碳流从甾类途径“分流”或“截流”至倍半萜类途径，最好的办法是抑制甾类合成酶的活性。由此便引出一条思路：能否在青蒿内导入鲨烯合酶的反义基因(antisense gene)抑制鲨烯合酶基因的表达或除去鲨烯合酶基因使甾类合成减少或消失？因此我们首先将青蒿的鲨烯合酶基因及其cDNA克隆并测序，然后在这一工作的基础上，拟构建根癌农杆菌Ti质粒衍生的基因打靶载体，将野生型鲨烯合酶基因替换成突变型鲨烯合酶基因，使青蒿体内的代谢活动朝着更有利于青蒿素合成的方向转变，从而实现青蒿分子育种的目标，为利用植物基因工程改造中药材(提高产量和品质)进行有益的探索。
参考文献：
[1]Klayman D L. Qinghaosu (Artemisinin): An antimalarial drug from China[J]. Science， 1985， 228: 1049.
[2]Shen M. The immunosuppression of artemisinin[J]. Sci Sin Series B， 1983， 10: 928.
[3]Yang X P. The antitumor effect of artemisinin succinate[J]. Cancer， 1997， 16: 186.
[4]Gong S X. Inhibition of tripcoumaric arginamidine and related amide compounds on HIV1 proteinase[J]. Foreign Medical Sciences: Chinese medicine， 2002， 24: 302.
[5]Vergauwe A， Cammaert R， Vanderberghe D. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of Artemisia annua L. and regeneration of transgenic plants[J]. Plant Cell Rep， 1996， 15: 929.
[6]Chen D H， Meng Y L， Ye H C， et at. Culture of transgenic Artemisia annua hairy root with cotton cadinenin synthase gene [J]. Acta Bot Sin， 1998， 40: 711.
[7]Paniego N B，Maligne A E，Giuletti A M.Artemisia annua(QuingHao):in vitro culture and the production of artemisinin[J].In:Bajaj Y P S.Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol V，Berlin:SpringerVerlg，1993.70-78.
基金项目：国家自然科学基金高技术探索项目(编号：30271591)、国家中医药管理局科研基金(编号：1020024)、广东省自然科学基金重点项目(编号：020799)和青蒿素科技基金资助课题(编号：qhs02a10)
(广州中医药大学热带医学研究所，广州510405), http://www.100md.com(冯丽玲， 曾庆平)
关键词：青蒿； 鲨烯合酶基因； DNA，重组； 序列分析，DNA
青蒿素是我国自主研发的抗疟原虫中药有效单体，对氯奎抗性疟原虫有效，现已成为全球抗疟药的希望。 青蒿素是青蒿经类异戊二烯次生代谢途径所形成的倍半萜衍生物。利用基因工程对青蒿进行基因敲变(knockdown)或敲除(knockout)已成为青蒿遗传改良的两大方向。为了研究在青蒿内导入鲨烯合酶基因反义序列，抑制鲨烯合酶基因表达或除去鲨烯合酶基因使青蒿素合成增加的可能性，我们克隆了青蒿鲨烯合酶基因，并经测序予以证实，为下一步培育转基因高产青蒿植株打下了基础。
1 材料
11 青蒿(Artemisia annua L.) 采自我国海南省三亚市(由四川引种)。
12 试剂 植物DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.Plant DNA Kit)、植物RNA提取试剂盒(E.Z.N.A.Plant RNA Kit)均购自 Omega公司；质粒DNA纯化试剂盒(Concert Rapid Plasmid Miniprep System)、DNA片段回收试剂盒(Concert Rapid Gel Extraction System)均购自 Life Technologies 公司； 聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒 ( One Shot LA PCR Mix)及逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增试剂盒(mRNA Selective PCR Kit)均购自 Takara公司；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。
2 方法
21 DNA的提取 按植物DNA提取试剂盒说明书提取青蒿植株的DNA。
22 RNA的提取 按植物RNA提取试剂盒说明书提取青蒿植株的总RNA。
23 引物设计 按GenBank AF405310、AF302464设计引物(SSPri5:5ATGAGTAGTTTGAAAGCAGTATTGAAACAC3；SSPri3:5TTACAAAGTGAATTTCTGCAGAGAGTAAGCA3；SSRNA:5TTACAAAGTGAATTTGATTTTATTGG3)，委托Takara公司合成。
24 PCR 扩增 以提取的青蒿DNA为模板，SSPri5、SSPri3为上下游引物，用Takara公司的One Shot LA PCR Mix扩增，扩增条件为： 94℃，1?min→94℃，30s，57℃，1min，72℃，5?min，30个循环→72℃，10?min→4℃。
25 RTPCR扩增 以提取的青蒿RNA为模板，SSPri5、SSRNA为上下游引物，用Takara公司的mRNA Selective PCR Kit扩增，扩增条件为： 50℃，30?s→85℃，1?min，50℃，1?min，72℃，5min，30个循环→72℃，10?min→4℃。
26 构建重组质粒 将PCR产物及RTPCR产物分别与pTarge T载体(Promega公司)连接，转化DH5α感受态细胞，涂板，蓝白斑筛选重组子。
27 重组质粒的鉴定及测序 用Life Technologies公司的试剂盒提取质粒，分别经PCR扩增和EcoRⅠ酶切进行鉴定。PCR扩增采用Promega公司的Tf1酶，反应条件为：94℃，1?min→94℃，30s，57℃，1min，72℃，5?min，30个循环→72℃，10?min→4℃。最后在 ABI Prism 310 DNA测序仪上用T7启动子引物测序。
3 结果
31 鲨烯合酶互补DNA(cDNA)扩增 青蒿植株RNA经RTPCR扩增和10?g/L凝胶电泳后，可检测到长度约为1?300?bp的DNA区带(见图1)。
32 鲨烯合酶基因扩增 青蒿植株DNA经PCR扩增和10?g/L凝胶电泳后，可检测到长度约为3?600?bp的DNA区带(见图2)。
33 鲨烯合酶基因克隆和鉴定 将扩增片段插入pTarge T载体后，获得重组质粒pTSSD。对 pTSSD 进行PCR扩增，经10?g/L凝胶电泳检测，可见与青蒿植株DNA的PCR产物大小相当的区带，表明上述扩增片段已与载体连接。将重组质粒用EcoRⅠ酶切，经10?g/L凝胶电泳后，可见一条略比青蒿植株DNA的PCR产物大的基因区带和另一条载体带(见图3)。
按实验设计，鲨烯合酶基因扩增片段的理论长度应为3?590?bp，插入T载体(5?670?bp)并用EcoRI酶切后，含有鲨烯合酶基因的酶切片段中尚包括68?bp载体片段，其实际长度应为3?658?bp。实验结果与此分析相符，初步表明青蒿鲨烯合酶基因已被克隆。
34 鲨烯合酶cDNA克隆和鉴定 将扩增片段插入pTarge T载体后获得重组质粒pTSSR。对pTSSR进行PCR扩增，经10?g/L凝胶电泳后检测到与青蒿植株RNA的RTPCR产物大小相当的区带，表明上述扩增片段已与载体连接。将重组质粒用EcoRⅠ酶切，经10?g/L凝胶电泳后，可见一条略比青蒿植株RNA的RTPCR产物大的基因区带和另一条载体带(见图4)。
按实验设计，鲨烯合酶cDNA 扩增片段的理论长度应为1?257?bp，插入T载体(5?670?bp)并用EcoRⅠ酶切后，含有鲨烯合酶cDNA 的酶切片段中包括68bp载体片段，其实际长度应为1?325?bp。实验结果与此分析相符，初步表明鲨烯合酶cDNA已被克隆。
35 鲨烯合酶基因及其cDNA序列分析
对上述两种重组质粒中的插入片段进行序列分析，结果显示pTSSD的插入片段为3?590?bp，pTSSR的插入片段为1?258?bp。经与GenBank中所发表的序列比较，显示两者都含有13个内含子，但序列之间存在某些碱基对的差别，推测这些差异可能源于单核苷酸多态性(SNP)。
鲨烯合酶基因及cDNA序列已被Genbank收录，编号分别为AY445505和AY445506。
测序结果与GenBank上已登录的青蒿鲨烯合酶基因序列同源性为99%，氨基酸序列同源性为100%。
1.λDNA/EcoRI+HindIII Markers； 2-4.RTPCR产物；5.对照
图1 青蒿植株RNA的RTPCR扩增产物(略)
1.对照；2-4.PCR产物； 5.λDNA/EcoRI+HindIII Markers
图2 青蒿植株DNA的PCR扩增产物(略)
1.pTSSD的EcoRⅠ酶切产物；2.空白对照；3.青蒿植株DNA的PCR产物； 4.λDNA/HindIII Markers
图3 pTSSD的PCR鉴定及酶切鉴定(略)
1.λDNA/HindIII Markers；2.青蒿植株RNA的RTPCR产物；3.pTSSR的EcoRⅠ酶切产物
图4 pTSSR的PCR鉴定及酶切鉴定(略)
4 讨论
青蒿(Artemisia annua L.)在临床上用于治疗暑热外感、阴虚发热、湿热黄疸诸证，其功用在历代本草中均有丰富记载。作为世界卫生组织极力推崇的抗疟药有效成分—青蒿素，是我国科学工作者从青蒿中分离出的化学单体[1]。同时，青蒿素还具有免疫调节功能[2]；青蒿素衍生物青蒿琥酯钠有抗肿瘤作用[3]；青蒿甲醇提取物N1N5N10三p香豆酰精脒及相关酰胺类化合物能抑制艾滋病毒蛋白酶活性[4]。由于受品种、产地和气候条件的限制，青蒿素的产量远不能满足市场需求，而常规栽培育种方法在提高青蒿素产量中的作用十分有限。因此，采用基因工程手段培育高产青蒿素品种正在受到国内外学者的关注[56]。国内外陆续开展了青蒿素生物合成关键酶基因及其克隆的研究工作，已相继克隆出从乙酰CoA至法呢基焦磷酸合成途径中的3个关键酶基因，它们是3羟3甲基戊二酰CoA还原酶基因、法呢基焦磷酸合酶基因、倍半萜合酶基因。自1993年Paniego 等[7]首次用根癌农杆菌T37菌株诱导青蒿幼茎组织产生芽状畸胎瘤以来，青蒿遗传转化技术逐步建立，并且日趋成熟。由此可见，通过植物基因工程改良青蒿以提高青蒿素的产量是大有可为的。
青蒿素为倍半萜类化合物，系由类异戊二烯途径合成而来，其中甾类与倍半萜类的生物合成途径分别处在两条不同的岔路上。从类异戊二烯途径中碳源的流向来看，甾类作为主要代谢产物自然成为碳流的主导者，而倍半萜类作为次生代谢产物则只能分享少量碳流。因此，为了将碳流从甾类途径“分流”或“截流”至倍半萜类途径，最好的办法是抑制甾类合成酶的活性。由此便引出一条思路：能否在青蒿内导入鲨烯合酶的反义基因(antisense gene)抑制鲨烯合酶基因的表达或除去鲨烯合酶基因使甾类合成减少或消失？因此我们首先将青蒿的鲨烯合酶基因及其cDNA克隆并测序，然后在这一工作的基础上，拟构建根癌农杆菌Ti质粒衍生的基因打靶载体，将野生型鲨烯合酶基因替换成突变型鲨烯合酶基因，使青蒿体内的代谢活动朝着更有利于青蒿素合成的方向转变，从而实现青蒿分子育种的目标，为利用植物基因工程改造中药材(提高产量和品质)进行有益的探索。
参考文献：
[1]Klayman D L. Qinghaosu (Artemisinin): An antimalarial drug from China[J]. Science， 1985， 228: 1049.
[2]Shen M. The immunosuppression of artemisinin[J]. Sci Sin Series B， 1983， 10: 928.
[3]Yang X P. The antitumor effect of artemisinin succinate[J]. Cancer， 1997， 16: 186.
[4]Gong S X. Inhibition of tripcoumaric arginamidine and related amide compounds on HIV1 proteinase[J]. Foreign Medical Sciences: Chinese medicine， 2002， 24: 302.
[5]Vergauwe A， Cammaert R， Vanderberghe D. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of Artemisia annua L. and regeneration of transgenic plants[J]. Plant Cell Rep， 1996， 15: 929.
[6]Chen D H， Meng Y L， Ye H C， et at. Culture of transgenic Artemisia annua hairy root with cotton cadinenin synthase gene [J]. Acta Bot Sin， 1998， 40: 711.
[7]Paniego N B，Maligne A E，Giuletti A M.Artemisia annua(QuingHao):in vitro culture and the production of artemisinin[J].In:Bajaj Y P S.Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol V，Berlin:SpringerVerlg，1993.70-78.
基金项目：国家自然科学基金高技术探索项目(编号：30271591)、国家中医药管理局科研基金(编号：1020024)、广东省自然科学基金重点项目(编号：020799)和青蒿素科技基金资助课题(编号：qhs02a10)
(广州中医药大学热带医学研究所，广州510405), http://www.100md.com(冯丽玲， 曾庆平)