逆转录病毒载体介导HSV1tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建
自杀基因,,自杀基因；,DNA，重组；,基因，肿瘤抑制；,基因疗法,1材料与方法,2结果,参考文献：
摘要：【目的】探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法。【方法】用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1tk)定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN，并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定；用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67，通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株，将病毒感染人胃癌细胞，检测HSV1tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。【结果】经酶切鉴定和DNA序列测定，证明HSV1tk基因成功定向插入到pLXSN载体中；重组病毒DNA转染包装细胞，筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67/tk，扩大培养，获取病毒滴度为4×104?cfu/mL的重组逆转录病毒培养液；感染胃癌细胞SGC7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC7901/tk。丙氧鸟苷(GCV)对SGC7901/tk有明显杀伤作用，对SGC7901无明显毒性，证明该病毒表达HSV1tk基因，表达产物具有生物活性。【结论】将HSV1tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达HSV1tk基因的逆转录病毒，成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统，这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础。关键词：自杀基因； DNA，重组； 基因，肿瘤抑制； 基因疗法
肿瘤的基因治疗，特别是自杀基因治疗，已经成为继传统手术切除、放射治疗、化学药物治疗等疗法之后一种新的抗肿瘤治疗措施。目前应用的肿瘤自杀基因治疗系统主要有[1]单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZVtk)、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(ECCD)；P53等。单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSVtk/GCV)治疗系统为最常用、最重要的治疗系统之一。
HSVtk基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶，可催化核苷类似物，如丙氧鸟苷(GCV)等，形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物，干扰细胞分裂时DNA合成，从而导致肿瘤细胞死亡[12]。
但由于在体内不可能每一肿瘤细胞都导入自杀基因，故旁观者效应(bystander effect)对基因治疗效果起到至关重要的作用。
旁观者效应不仅可使导入自杀基因的细胞杀死，还使邻近未导入的细胞也被杀死[34]。
研究表明，旁观者效应与机体的免疫状态密切相关[56]；许多中医方药能有效提高机体的免疫功能[79]，这就有可能通过调节自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境，使荷瘤机体从免疫抑制转化为免疫激活，从而增强自杀基因的旁观者效应 ......
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