摘 要 常规全细胞膜片钳模式形成的同时，细胞内液与电极液交换造成细胞内物质丢失，此现象对小细胞的影响更为明显。穿孔膜片钳技术使电极与细胞胞质之间保持电学连续性，它使细胞内环境保持稳定，利于研究胞内信息传导机制，并可改善常规全细胞膜片钳时破膜所造成的封接稳定性的破坏，有望提高实验的成功率。本研究报道应用此技术在猪冠状动脉平滑肌细胞上记录的全细胞K + 电流和由大电导钙激活钾通道BKCa所介导的自发瞬时外向电流ISTOCs。

    关键词 穿孔膜片钳技术;常规全细胞膜片钳技术;BKCa通道;自发瞬时外向电流;两性霉素-B 1 前言

    在全细胞记录状态形成的同时，细胞内液与电极液之间灌流造成的细胞内物质丢失(washout)，此现象对小细胞的影响尤为明显，此法可造成细胞内固有的可溶性有机分子丢失，而丢失的这类有机分子可能在维持离子通道活性和细胞内信号传递机制中起重要作用。已发现全细胞记录法可出现钙通道机能下降(rundown)等现象 [1，2] ，此外用全细胞记录法记录由受体介导的胞内信号传导机制时常出现记录失败的现象 [2] ，而且细胞内钙缓冲能力的变化也是其缺陷之一 [3] 。

    本研究室多年来从事猪冠状动脉平滑肌细胞BKCa通道的研究，此细胞体积微小(约为15×4μm 2 ) [4，5] ，已进行的研究表明常规全细胞膜片钳记录时，易引起细胞内物质丢失，而且在负压抽吸破膜或进行电穿孔时，原已形成巨阻封接的细胞容易脱落，即使形成全细胞模式，破口处也很容易被破膜形成的细胞碎片重新堵住，造成记录电流衰减的假象，最终引起记录失败。在研究胞内钙浓度局部瞬时增加(钙火花，calcium spark)对平滑肌细胞上由BKCa通道开放所介导的STOCs(spontaneous transient outward currents，自发瞬时外向电流)时，即使在电极液内添加能量如ATP，GTP，腺苷，也可能由于细胞内钙缓冲能力的变化而很难记录到STOCs，有的细胞在破膜后短时间内可记录到STOCs，稍后就再也无法记录到 [6] 。

    因此常规全细胞膜片钳记录法有一定缺陷，在一些特定的研究中其应用受到限制，为此摸索出适合我们研究，特别是进行胞内信号传导机制研究时稳定的穿孔膜片钳技术有重要意义，将为后续的工作奠定良好的实验基础。本实验通过记录猪冠状动脉平滑肌细胞的STOCs，比较穿孔膜片钳记录法与常规全细胞膜片钳记录法的差别，现报道如下。

     2 实验方法

    2.1 电极内液和浴液的配制 注意在穿孔膜片钳记录时电极液和浴液中氯离子和不通透的阴离子浓度要对称 ...... 濠碘€冲€归悘澶愬箖閵娿儲韬ù锝堟硶閺併倝骞嶇€ｎ偅绨氱紒娑橆槹缁侊妇鎲撮崼鐔割槯闁哄啰濮电涵鍫曞蓟閵壯勭畽闁瑰瓨鐗旂粭鍛姜閽樺寮块柡鍌氭祫缁辨繈宕ｉ婵嗗幋闁哄嫷鍨甸～锕傚箹濠婂懎鍋嶇€殿喗娲橀幖鍛婂緞鏉堚晜鍩傞柍銉︾矎濞村棝鎯嶆担娴嬪亾濠垫挾绀夐悹鍥棑閸嬶綁宕欑拠鑼綄妤犵偞娲樺〒鑸电▔鐎ｎ偅鐓欓柣銊ュ閳ь剚绮庨弫鎼佹嚇閹寸姴顣奸柍銉︾箖閸ㄣ劑鍨惧⿰鍐ㄦ枾缂傚啯鍨块妴澶愬灳濠靛⿴鍟忛梻鍌ゅ枔閳ь剨鎷�


闂傚嫭鍔掔花顒勫嫉瀹ュ懎顫ら柛锝冨妼鐢洭宕濆☉宕囩缂傚啯鍨归悵顖炴焾閵娿儱鐎诲ǎ鍥ｅ墲娴煎懘宕ｉ鍐繑闁绘牕宕缓鐐濮橆剚鍠呴柟瀛樼墬濠€浣圭▔閳ь剛鈧姘ㄨⅶ闁告帒妫涘▓鎴濃枖閵娿儱鏂€濞村吋鑹鹃幉鍐裁规担绛嬫綌闁靛棴鎷�
婵繐鎷�濞ｅ洠鍓濇导锟�闂傚洠鍋撻悷鏇嫹 2 缂佸鍨伴崹搴ㄦ晬閸繂甯抽悹鎰潐閺佺偤宕樺畝鈧▍銉ㄣ亹閺囩偞鍊�婵絽绻愰妵澶愬矗椤栨瑤绨板Λ鏉挎瑜帮拷10濞戞搩浜炶ⅶ闁告帪鎷�闁挎稑顦埀顒婃嫹
    濠电儑绲藉ú鐘诲礈濠靛洤顕遍柛娑卞枤椤╃兘鏌涘☉鍗炲閺夆晜妫冮弻娑樷枎韫囨挴鍋撴禒瀣劦妞ゆ巻鍋撻柛鐘崇〒濡叉劕鈹戦崶鈹炬灃閻庡箍鍎卞Λ娑㈠焵椤掑鐏︽鐐差儔楠炲洭顢旈崨顓炵哎濠电偠鎻徊鎯洪幋鐘典笉闁挎繂鎷嬮崵鍫澪旈敂绛嬪劌闁哥偞鎸抽弻鏇㈠幢閺囩姴濡介柣銏╁灠缂嶅﹪骞婇敓鐘茬疀妞ゆ挾鍋熸禒鎰版⒑閸︻厐鐟懊洪妶鍥潟闁冲搫鎳庤繚闂佺ǹ鏈粙鎺楁倵椤斿墽纾奸柡鍐ㄥ€稿暩婵犫拃鍕垫疁鐎殿喖鐖煎畷姗€濡歌閸撴垶绻涚€涙ḿ鐭婂Δ鐘叉憸閺侇噣顢曢敂钘夘€涘┑锛勫仜婢х晫绮欐繝鍥ㄧ厸濠㈣泛锕ら弳鏇熸叏閻熼偊妯€闁轰礁绉撮悾婵嬪礃椤垳鎴烽梻浣筋嚃閸犳捇宕濊箛娑辨晣缂備焦岣块埢鏃堟煟閹寸儑渚涢柛鏂垮暣閺岋繝宕掑顓犵厬缂備焦顨呴ˇ閬嶅焵椤掑喚娼愮紒顔肩箻閿濈偤鏁冮崒姘卞摋闁荤娀缂氬▍锝囩矓閸喓鈧帒顫濋鐘闂侀潧娲ゅú銊╁焵椤掑偆鏀版繛澶嬬洴瀹曘垽濡堕崶銊ヮ伕閻熸粎澧楃敮妤咃綖婢舵劖鍋ｉ柛銉娑撹尙绱掓潏銊х畼闁归濞€閹粓鎸婃径澶岀梾濠电偛顕慨楣冨春閺嶎厼鍨傞柕濞炬櫆閸嬨劌霉閿濆懎鏆熸俊顖氱墦濮婃椽顢曢敐鍡欐闂佺粯鎼换婵嬬嵁鐎ｎ喖绠ｆ繝濠傚閹枫劑姊洪幐搴ｂ槈闁哄牜鍓熷畷鐟扳堪閸曨収娴勫銈嗗笂閻掞箓寮抽鍫熺厱闁瑰搫绉村畵鍡涙煃瑜滈崜姘潩閵娾晜鍋傞柨鐔哄Т鐟欙箓骞栭幖顓炵仯缂佲偓婢跺⊕褰掑礂閸忚偐娈ら梺缁樼箖閻╊垰鐣烽敓鐘茬闁肩⒈鍓氶鎴︽⒑鐠団€虫灁闁告柨楠搁埢鎾诲箣閻愭潙顎撳┑鐘诧工閸燁垶骞嗛崒姣綊鎮╅幓鎺濆妷濠电姭鍋撻柟娈垮枤绾鹃箖鏌熺€电ǹ啸鐟滅増鐓￠弻娑㈠箳閺傚簱鏋呭┑鐐叉噹闁帮絾淇婇幘顔芥櫢闁跨噦鎷�

闁诲海鏁婚崑濠囧窗閺囩喓鈹嶅┑鐘叉搐濡﹢鏌涢妷銏℃珖鐟滃府鎷�  闂備胶枪缁绘鈻嶉弴銏犳瀬闁绘劗鍎ら崕宀勬煟閹伴潧澧い搴嫹  闂佽崵濮村ú銈団偓姘煎灦椤㈡瑩骞嬮敃鈧粈鍕煟濡绲荤紓宥忔嫹  闂備胶鎳撻崥瀣垝鎼淬劌纾奸柕濞炬櫅閸楁娊鏌℃径瀣劸婵☆垽鎷�