胃癌组织Fas基因表达与细胞凋亡和增殖的关系
Relationship between Fas gene expression and cell proliferation and apoptosis in gastric cancer tissue
LIU HaiFeng1,LIU WeiWen2,CHEN Gang2,WANG XingWei2,JIANG LiGuo1
1Department of Gastroenterology,General Hospital,Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039,China,2PLA Center of Digestive Medicine,Xinan Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China
【Abstract】AIM: To investigate the relationship between Fas gene expression level in human gastric carcinomas and the frequency of cell proliferation activity and the apoptosis of the tumor cells.METHODS: In situ hybridization and immunohistochemistry methods were used to study the frequencies of expression of Fas gene and proliferating cell antigen (PCNA) in 53 gastric carcinomas.An in situ apoptotic cell detection method (TUNEL method) was also adopted to detect the apoptotic cells.The number of apoptotic cells and PCNA cells was compared with the Fas protein expression in each case.RESULTS: Of the 53 gastric carcinomas,28(528%) and 24(453%) expressed Fas mRNA and Fas protein respectively.There was no significant difference in the positivity rates obtained by these 2 methods.The apoptotic index and PCNA index of gastric carcinomas were correlated negatively (r=-0982,P<001).With the increase in the expression of Fas protein,the cell proliferating activity decreased and apoptosis increased in the tumor cells.There was significant difference in apoptosis indices between Fas protein group and -/+ group (P<001).The PCNA index in Fas protein group was significantly higher than that in and groups(P<001).CONCLUSION: Fas gene can promote apoptosis and inhibit cell proliferation in the development and malignant progression of gastric carcinomas.
【Keywords】stomach neoplasms；fas gene；apoptosis；cell differentiation
【摘 要】 目的： 探讨Fas基因表达水平与胃癌细胞增殖活性及细胞凋亡程度的关系.方法： 胃癌组织53例，用原位杂交及免疫组化染色法分别检测Fas mRNA，Fas蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，并采用凋亡细胞原位检测方法对组织切片中的凋亡细胞进行观察和比较.结果： 胃癌组织表达Fas mRNA 28例(528%)，表达Fas蛋白24例(453%)，两种方法检测结果一致性非常显著(P<001).胃癌53例增殖期细胞标记物PCNA表达及凋亡细胞的阳性率均为100%，细胞凋亡和细胞增殖指数呈显著性负相关(r=-0982，P<001).随胃癌细胞Fas蛋白表达水平升高，PCNA阳性细胞指数相应减少，肿瘤凋亡细胞指数则相应增加.Fas蛋白组细胞凋亡指数显著高于-/+组(P<001)，Fas蛋白组PCNA指数显著高于/组(P<001).结论： 胃癌细胞Fas基因表达可引起细胞凋亡增加与增殖减少.
【关键词】 胃肿瘤；Fas基因；细胞凋亡；细胞分化
0引言
胃癌的发生发展与肿瘤细胞增殖及其凋亡有关系.Fas抗原可介导细胞凋亡，在胃癌及胃癌前病变组织中均有表达，参与细胞凋亡的调控[1，2].我们采用 mRNA 原位杂交和免疫组织化学染色技术检测胃癌组织中Fas基因表达，并应用细胞凋亡原位检测方法和免疫组化染色对胃癌组织中细胞凋亡、增殖的情况进行观察，探讨其与Fas蛋白表达之间可能的关系.
1材料和方法
1.1 材料 1994/1996年胃远端癌手术切除标本53例，术前均未接受化放疗或免疫治疗.每份标本的一半立即用冷冻包埋剂(OCT)包埋，液氮快速冷冻，-70℃冰箱保存.另一半组织标本经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，并经HE染色病理诊断证实.原位杂交前，将冷藏标本取出复温至-23℃，用恒冷切片机做6 μm连续冷冻切片，室温干燥10 min，-70℃保存备用.PCNA及Fas多克隆抗体均购自Santa Cruz公司；SP免疫染色试剂盒购于福建迈新生物工程公司；地高辛标记及检测试剂盒以及细胞凋亡原位检测试剂盒均为Boehringer Mannheim公司产品；Fas寡核苷酸探针由中科院上海生物工程研究中心合成.探针序列为：5′ GTGTTTCAGGATTTAAGGTTGGAGATT3′.探针标记按试剂盒说明进行，探针标记后分别作探针显色灵敏度及杂交灵敏度检测.
1.2方法
1.2.1原位杂交载玻片上涂多聚赖氨酸(1 g/L)，室温干燥，石蜡组织贴于载玻片上，65℃烤片3 h，二甲苯脱蜡，乙醇逐级入水，100 mg/L蛋白酶K消化，37℃ 20 min；4 mL/L多聚甲醛后固定5 min，依次用2×SSC，三蒸水处理后，乙醇逐级脱水；滴加预杂交液(500 mL/L甲酰胺；6×SSC，5 mL/L SDS，5×Danhardt溶液： 1 g/L聚乙烯吡咯烷酮，1 g/L牛血清白蛋白，1 g/L水溶性聚蔗糖400，200 mg/L ssDNA)，42℃预杂交2 h，吸弃载玻片上预杂交液，每片滴加杂交液50 μL，置于湿盒中42℃杂交过夜.杂交后按下述程序严格冲洗： 01 mL/L SDS 2×SSC 42℃ 10 min 2次，500 mL/L甲酰胺2×SSC室温10 min 2次，500 mL/L甲酰胺05×SSC室温10 min 2次，02×SSC室温5 min 1次，01×SSC室温2 min 1次.显色满意后水洗终止，封片除阳性对照外，设无探针阴性对照及RNase处理后的阴性对照.
1.2.2免疫组化染色石蜡切片免疫组化染色按SP法进行，抗PCNA及Fas多抗1∶100稀释.以PBS替代一抗作为空白对照，正常血清替代一抗作为替代对照.用已知阳性切片作为阳性对照.光镜下计数Fas mRNA和蛋白阳性肿瘤细胞数，将其分为4个等级: -，无阳性细胞；+，阳性细胞<25%;，阳性细胞占25~50%;，阳性细胞>50%.
1.2.3TUNEL染色石蜡切片，蛋白酶K (20 mg/L) 37℃消化20 min，PBS(pH74)洗5 min，3次；滴加TUNEL反应液37℃孵育1 h，PBS洗5 min，3次；滴加抗荧光素抗体过氧化物酶联结物37℃ 30 min，PBS洗5 min，3次；DAB显色，苏木素复染，封片.阴性对照设以PBS替代TUNEL反应液的空白对照，阳性对照切片经DNaseI预处理10 min，再接上述染色步骤.光镜下观察TUNEL染色及PCNA免疫组化染色切片的显色反应，数5个以上高倍视野，不少于500个细胞，计数阳性细胞数，分别作为TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)指数及PCNA阳性细胞(增殖细胞)指数.
统计学处理： 采用χ2检验、方差分析和Spearman秩相关分析进行统计学处理.
2结果
2.1Fas mRNA及其蛋白的表达在胃癌组织中Fas mRNA原位杂交阳性信号为紫蓝色或棕蓝色颗粒，主要集中在胞质内(Fig 1A).Fas 蛋白免疫组化阳性信号呈棕黄色颗粒，位于细胞质内和(或)细胞膜上，未见核内表达(Fig 1B).在53例胃癌中，有28例(528%)不同程度地表达Fas mRNA，Fas mRNA-，+，，者分别占472%，189%，151%和189%.不同程度地表达Fas蛋白24例(453%)，Fas 蛋白-，+，，者分别占547%，151%，170%和132%经一致性检验表明，原位杂交及免疫组化两种方法对Fas基因表达检测结果一致性非常显著(P<001)，在53例标本中两种方法检测结果一致者占849%.
2.2胃癌细胞凋亡和增殖与Fas蛋白表达的关系TUNEL染色阳性反应物质呈棕黄色，位于细胞核内，浓缩的核质紧贴于核膜，或核质呈现均匀的染色，凋亡细胞呈弥漫性、簇状和(或)散在分布(Fig 1C)；未凋亡细胞非特异性染色极浅，而坏死组织染色呈片状，细胞轮廓不清，染色呈均一深染的棕黄色斑片.PCNA染色阳性物质呈棕黄色颗粒状均匀分布，主要位于细胞核内，PCNA阳性细胞在胃癌组织中呈弥漫性分布(Fig 1D).53例胃癌细胞凋亡和PCNA表达的阳性率均为100%，细胞凋亡指数为58%，PCNA指数为475%，秩相关分析证实两者间呈显著性负相关(rs=-0982，P<001).PCNA阳性指数随胃癌细胞Fas蛋白表达水平升高而相应减少，细胞凋亡指数随胃癌细胞Fas蛋白表达水平升高而相应增加.Fas蛋白组细胞凋亡指数显著高于-组与+组(P<001)，亦高于组，但相差无统计学意义.Fas蛋白组PCNA指数显著高于组与组()，亦高于+组，但相差无统计学意义(Tab 1).经连续切片观察，Fas蛋白表达与细胞凋亡在多数病例具有同域性.
表1胃癌组织Fas蛋白表达与细胞凋亡和增殖的关系 (略)
图1胃癌组织Fas表达与细胞凋亡/增殖 (略)
3讨论
胃癌发生发展可能伴随一系列基因的改变，进一步探讨胃癌组织Fas基因表达水平与胃癌细胞增殖活性及细胞凋亡程度的关系，有助于揭示胃癌发生的机制.在非淋巴系恶性肿瘤中的许多肿瘤细胞有广泛的Fas抗原表达，如结肠癌、乳腺癌、肝癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、恶性胶质瘤等[3].Fas抗原在胃癌和胃癌前病变组织中亦有表达[2].我们发现，胃癌细胞普遍存在Fas蛋白翻译及核酸转录水平的异常表达，可能与胃癌的发生、发展及浸润性生长密切相关.细胞过度增殖和(或)细胞凋亡减少是胃癌发生的生物学基础[4]，但其机制尚不明确.本结果提示，Fas 基因表达异常增加可促进胃癌细胞凋亡，促进强度随胃癌细胞Fas基因表达水平升高而相应增加.我们认为在胃癌发生发展过程中，Fas基因表达减少或丢失可能是胃癌细胞逃避凋亡、无限增殖的机制之一.
【参考文献】
[1] De Luca A, Laquinto G.Helicobacter pylori and gastric diseases：A dangerous association [J].Cancer Lett,2004；213(1)：1-10.
[2] 刘海峰，刘为纹，房殿春.胃癌前组织和胃癌中Fas基因表达及其与细胞凋亡的关系[J].第三军医大学学报,2001；23(9)：1018-1020.Liu HF,Liu WW,Fang DC.Fas gene expression and its relationship with apoptosis in human gastric carcinoma and precancerous lesions[J ].Third Mil Med Univ,2001；23(9)：1018-1020.
[3] Lim SC.Fasrelated apoptosis in gastric adenocarcinoma[J].Oncol Rep,2003；10(1)：57-63.
[4] 刘海峰，刘为纹，房殿春，等.幽门螺杆菌感染与胃癌前病变演化的关系[J].世界华人消化杂志,2002；10(8):912-915.Liu HF,Liu WW,Fang DC，et al.Relationship between Helicobacter pylori infection and gastric precancerous lesions： A followup study[J].World Chin Digest,2002；10(8):912-915.
1 武警总医院消化科，北京100039
2第三军医大学西南医院全军消化内科中心，重庆400038
基金项目：军队医药卫生“九五”重点课题(96Z047)；重庆市应用基础研究基金(199806)
编辑许昌泰, http://www.100md.com(刘海峰 刘为纹 陈刚 汪兴伟 姜利国)
LIU HaiFeng1,LIU WeiWen2,CHEN Gang2,WANG XingWei2,JIANG LiGuo1
1Department of Gastroenterology,General Hospital,Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039,China,2PLA Center of Digestive Medicine,Xinan Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China
【Abstract】AIM: To investigate the relationship between Fas gene expression level in human gastric carcinomas and the frequency of cell proliferation activity and the apoptosis of the tumor cells.METHODS: In situ hybridization and immunohistochemistry methods were used to study the frequencies of expression of Fas gene and proliferating cell antigen (PCNA) in 53 gastric carcinomas.An in situ apoptotic cell detection method (TUNEL method) was also adopted to detect the apoptotic cells.The number of apoptotic cells and PCNA cells was compared with the Fas protein expression in each case.RESULTS: Of the 53 gastric carcinomas,28(528%) and 24(453%) expressed Fas mRNA and Fas protein respectively.There was no significant difference in the positivity rates obtained by these 2 methods.The apoptotic index and PCNA index of gastric carcinomas were correlated negatively (r=-0982,P<001).With the increase in the expression of Fas protein,the cell proliferating activity decreased and apoptosis increased in the tumor cells.There was significant difference in apoptosis indices between Fas protein group and -/+ group (P<001).The PCNA index in Fas protein group was significantly higher than that in and groups(P<001).CONCLUSION: Fas gene can promote apoptosis and inhibit cell proliferation in the development and malignant progression of gastric carcinomas.
【Keywords】stomach neoplasms；fas gene；apoptosis；cell differentiation
【摘 要】 目的： 探讨Fas基因表达水平与胃癌细胞增殖活性及细胞凋亡程度的关系.方法： 胃癌组织53例，用原位杂交及免疫组化染色法分别检测Fas mRNA，Fas蛋白和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，并采用凋亡细胞原位检测方法对组织切片中的凋亡细胞进行观察和比较.结果： 胃癌组织表达Fas mRNA 28例(528%)，表达Fas蛋白24例(453%)，两种方法检测结果一致性非常显著(P<001).胃癌53例增殖期细胞标记物PCNA表达及凋亡细胞的阳性率均为100%，细胞凋亡和细胞增殖指数呈显著性负相关(r=-0982，P<001).随胃癌细胞Fas蛋白表达水平升高，PCNA阳性细胞指数相应减少，肿瘤凋亡细胞指数则相应增加.Fas蛋白组细胞凋亡指数显著高于-/+组(P<001)，Fas蛋白组PCNA指数显著高于/组(P<001).结论： 胃癌细胞Fas基因表达可引起细胞凋亡增加与增殖减少.
【关键词】 胃肿瘤；Fas基因；细胞凋亡；细胞分化
0引言
胃癌的发生发展与肿瘤细胞增殖及其凋亡有关系.Fas抗原可介导细胞凋亡，在胃癌及胃癌前病变组织中均有表达，参与细胞凋亡的调控[1，2].我们采用 mRNA 原位杂交和免疫组织化学染色技术检测胃癌组织中Fas基因表达，并应用细胞凋亡原位检测方法和免疫组化染色对胃癌组织中细胞凋亡、增殖的情况进行观察，探讨其与Fas蛋白表达之间可能的关系.
1材料和方法
1.1 材料 1994/1996年胃远端癌手术切除标本53例，术前均未接受化放疗或免疫治疗.每份标本的一半立即用冷冻包埋剂(OCT)包埋，液氮快速冷冻，-70℃冰箱保存.另一半组织标本经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，并经HE染色病理诊断证实.原位杂交前，将冷藏标本取出复温至-23℃，用恒冷切片机做6 μm连续冷冻切片，室温干燥10 min，-70℃保存备用.PCNA及Fas多克隆抗体均购自Santa Cruz公司；SP免疫染色试剂盒购于福建迈新生物工程公司；地高辛标记及检测试剂盒以及细胞凋亡原位检测试剂盒均为Boehringer Mannheim公司产品；Fas寡核苷酸探针由中科院上海生物工程研究中心合成.探针序列为：5′ GTGTTTCAGGATTTAAGGTTGGAGATT3′.探针标记按试剂盒说明进行，探针标记后分别作探针显色灵敏度及杂交灵敏度检测.
1.2方法
1.2.1原位杂交载玻片上涂多聚赖氨酸(1 g/L)，室温干燥，石蜡组织贴于载玻片上，65℃烤片3 h，二甲苯脱蜡，乙醇逐级入水，100 mg/L蛋白酶K消化，37℃ 20 min；4 mL/L多聚甲醛后固定5 min，依次用2×SSC，三蒸水处理后，乙醇逐级脱水；滴加预杂交液(500 mL/L甲酰胺；6×SSC，5 mL/L SDS，5×Danhardt溶液： 1 g/L聚乙烯吡咯烷酮，1 g/L牛血清白蛋白，1 g/L水溶性聚蔗糖400，200 mg/L ssDNA)，42℃预杂交2 h，吸弃载玻片上预杂交液，每片滴加杂交液50 μL，置于湿盒中42℃杂交过夜.杂交后按下述程序严格冲洗： 01 mL/L SDS 2×SSC 42℃ 10 min 2次，500 mL/L甲酰胺2×SSC室温10 min 2次，500 mL/L甲酰胺05×SSC室温10 min 2次，02×SSC室温5 min 1次，01×SSC室温2 min 1次.显色满意后水洗终止，封片除阳性对照外，设无探针阴性对照及RNase处理后的阴性对照.
1.2.2免疫组化染色石蜡切片免疫组化染色按SP法进行，抗PCNA及Fas多抗1∶100稀释.以PBS替代一抗作为空白对照，正常血清替代一抗作为替代对照.用已知阳性切片作为阳性对照.光镜下计数Fas mRNA和蛋白阳性肿瘤细胞数，将其分为4个等级: -，无阳性细胞；+，阳性细胞<25%;，阳性细胞占25~50%;，阳性细胞>50%.
1.2.3TUNEL染色石蜡切片，蛋白酶K (20 mg/L) 37℃消化20 min，PBS(pH74)洗5 min，3次；滴加TUNEL反应液37℃孵育1 h，PBS洗5 min，3次；滴加抗荧光素抗体过氧化物酶联结物37℃ 30 min，PBS洗5 min，3次；DAB显色，苏木素复染，封片.阴性对照设以PBS替代TUNEL反应液的空白对照，阳性对照切片经DNaseI预处理10 min，再接上述染色步骤.光镜下观察TUNEL染色及PCNA免疫组化染色切片的显色反应，数5个以上高倍视野，不少于500个细胞，计数阳性细胞数，分别作为TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)指数及PCNA阳性细胞(增殖细胞)指数.
统计学处理： 采用χ2检验、方差分析和Spearman秩相关分析进行统计学处理.
2结果
2.1Fas mRNA及其蛋白的表达在胃癌组织中Fas mRNA原位杂交阳性信号为紫蓝色或棕蓝色颗粒，主要集中在胞质内(Fig 1A).Fas 蛋白免疫组化阳性信号呈棕黄色颗粒，位于细胞质内和(或)细胞膜上，未见核内表达(Fig 1B).在53例胃癌中，有28例(528%)不同程度地表达Fas mRNA，Fas mRNA-，+，，者分别占472%，189%，151%和189%.不同程度地表达Fas蛋白24例(453%)，Fas 蛋白-，+，，者分别占547%，151%，170%和132%经一致性检验表明，原位杂交及免疫组化两种方法对Fas基因表达检测结果一致性非常显著(P<001)，在53例标本中两种方法检测结果一致者占849%.
2.2胃癌细胞凋亡和增殖与Fas蛋白表达的关系TUNEL染色阳性反应物质呈棕黄色，位于细胞核内，浓缩的核质紧贴于核膜，或核质呈现均匀的染色，凋亡细胞呈弥漫性、簇状和(或)散在分布(Fig 1C)；未凋亡细胞非特异性染色极浅，而坏死组织染色呈片状，细胞轮廓不清，染色呈均一深染的棕黄色斑片.PCNA染色阳性物质呈棕黄色颗粒状均匀分布，主要位于细胞核内，PCNA阳性细胞在胃癌组织中呈弥漫性分布(Fig 1D).53例胃癌细胞凋亡和PCNA表达的阳性率均为100%，细胞凋亡指数为58%，PCNA指数为475%，秩相关分析证实两者间呈显著性负相关(rs=-0982，P<001).PCNA阳性指数随胃癌细胞Fas蛋白表达水平升高而相应减少，细胞凋亡指数随胃癌细胞Fas蛋白表达水平升高而相应增加.Fas蛋白组细胞凋亡指数显著高于-组与+组(P<001)，亦高于组，但相差无统计学意义.Fas蛋白组PCNA指数显著高于组与组()，亦高于+组，但相差无统计学意义(Tab 1).经连续切片观察，Fas蛋白表达与细胞凋亡在多数病例具有同域性.
表1胃癌组织Fas蛋白表达与细胞凋亡和增殖的关系 (略)
图1胃癌组织Fas表达与细胞凋亡/增殖 (略)
3讨论
胃癌发生发展可能伴随一系列基因的改变，进一步探讨胃癌组织Fas基因表达水平与胃癌细胞增殖活性及细胞凋亡程度的关系，有助于揭示胃癌发生的机制.在非淋巴系恶性肿瘤中的许多肿瘤细胞有广泛的Fas抗原表达，如结肠癌、乳腺癌、肝癌、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、恶性胶质瘤等[3].Fas抗原在胃癌和胃癌前病变组织中亦有表达[2].我们发现，胃癌细胞普遍存在Fas蛋白翻译及核酸转录水平的异常表达，可能与胃癌的发生、发展及浸润性生长密切相关.细胞过度增殖和(或)细胞凋亡减少是胃癌发生的生物学基础[4]，但其机制尚不明确.本结果提示，Fas 基因表达异常增加可促进胃癌细胞凋亡，促进强度随胃癌细胞Fas基因表达水平升高而相应增加.我们认为在胃癌发生发展过程中，Fas基因表达减少或丢失可能是胃癌细胞逃避凋亡、无限增殖的机制之一.
【参考文献】
[1] De Luca A, Laquinto G.Helicobacter pylori and gastric diseases：A dangerous association [J].Cancer Lett,2004；213(1)：1-10.
[2] 刘海峰，刘为纹，房殿春.胃癌前组织和胃癌中Fas基因表达及其与细胞凋亡的关系[J].第三军医大学学报,2001；23(9)：1018-1020.Liu HF,Liu WW,Fang DC.Fas gene expression and its relationship with apoptosis in human gastric carcinoma and precancerous lesions[J ].Third Mil Med Univ,2001；23(9)：1018-1020.
[3] Lim SC.Fasrelated apoptosis in gastric adenocarcinoma[J].Oncol Rep,2003；10(1)：57-63.
[4] 刘海峰，刘为纹，房殿春，等.幽门螺杆菌感染与胃癌前病变演化的关系[J].世界华人消化杂志,2002；10(8):912-915.Liu HF,Liu WW,Fang DC，et al.Relationship between Helicobacter pylori infection and gastric precancerous lesions： A followup study[J].World Chin Digest,2002；10(8):912-915.
1 武警总医院消化科，北京100039
2第三军医大学西南医院全军消化内科中心，重庆400038
基金项目：军队医药卫生“九五”重点课题(96Z047)；重庆市应用基础研究基金(199806)
编辑许昌泰, http://www.100md.com(刘海峰 刘为纹 陈刚 汪兴伟 姜利国)