17β雌二醇的神经保护作用与磷脂酰肌醇3激酶的活性关系
Relationship between neuroprotective effect of 17βestradiol and activity of phosphatidylinositol3kinase
YU XiaoRui1, ZHANG XiaoLing2, GAO GuangDao3, CAO Wei4
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, 3Department of Pathobiology, Medical College, 2Department of Ophthalmology, First Hospital, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China, 4Dean A. McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City OK. USA 73104
【Abstract】 AIM: To investigate the relationship between the retinal neuroprotective effect of βE2 and the activity of PI3K. METHODS: The relationship between the retinal neuroprotective effect of βE2 and activity of PI3K was investigated by methods of cultured retinal neurons, MTT assay, PI3K assay and Western blot analysis. RESULTS: PI3K activity was increased by a 30 min treatment of cultured retinal neurons with 10 μmol/L βE2 and reached a plateau at 1 h. The PI3K activity returned to control level after 12 h. The incubation of βE2 directly with a homogenate of cultured retinal neurons did not activate PI3K and the expression of PI3K did not respond to βE2 treatment. LY294002, a PI3K inhibitor, greatly inhibited the βE2 attenuated H2O2induced cytotoxicity. CONCLUSION: βE2 can significantly activate PI3K in cells in an indirect way and LY294002 can significantly inhibit the retinal nueroprotection provided by βE2, suggesting that neuroprotective effects of βE2 are related to the activation of PI3K.
【Keywords】 17 β estradiol; phosphatidylinositol3kinase; retina; neurons
【摘要】 目的: 研究17β雌二醇(βE2)保护视网膜神经细胞的作用与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的活性关系. 方法: 应用视网膜神经细胞培养、MTT测定、PI3K活性测定及Western blot分析的方法，观察βE2与视网膜神经细胞PI3K的关系. 结果: 10 μmol/L βE2培养细胞30 min后，PI3K的活性开始上升，1 h达高峰，12 h恢复正常. 用βE2直接与细胞匀浆37℃孵育1 h，PI3K活性没有改变. 而且βE2也未影响PI3K在细胞中的表达. PI3K抑制剂 LY294002降低了βE2削弱H2O2的毒性作用. 结论: βE2能间接激活细胞中PI3K的活性，LY294002抑制了βE2保护视网膜神经细胞的作用. 提示βE2的神经保护作用可能与PI3K的激活有关.
【关键词】 17β雌二醇；磷脂酰肌醇3激酶；视网膜; 神经细胞
0引言
近来大量研究表明17β雌二醇(17βestradiol, βE2)具有保护神经细胞、防止神经退化的作用[1，2] . 我们的研究[3]也发现βE2能削弱H2O2诱导的视网膜神经细胞的死亡，对视网膜神经细胞起保护作用. 磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3kinase, PI3K)是众多生命活动中的关键信号分子，与细胞生长、分化、迁移及死亡等的调控密切相关. 近来研究[4]发现某些神经营养因子可通过PI3K介导的信号传导途经发挥其保护神经细胞的作用. 在视网膜对光刺激的反应研究中也发现，光能激活细胞中PI3K的活性，通过PI3K介导的途经保护视网膜免遭光对其造成的损伤[5]. 为了解βE2保护视网膜神经细胞的作用是否与PI3K介导的信号传导途经有关，我们研究了PI3K的活性与βE2保护视网膜神经细胞的作用关系.
1材料和方法
1.1材料DMEM/F12培养基为GibcoBrl公司产品;γ32pATP为Perkinelmer Life Sciences产品; 磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PI4，5P2) 为Echeloreserch Laboratories公司产品;PI3K调节亚基p85抗体为Upstate Biotechnology公司产品; LY294002为Calbiochem公司产品；其他试剂均为Sigma公司产品. SD大鼠由美国俄克拉荷马大学眼科研究所实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1视网膜神经细胞的原代培养取10~15只出生48 h之内的新生SD大鼠，无菌条件下断头处死，立即剥离视网膜， PBS冲洗2～3次后将所有剥离的视网膜悬浮在含25 mL, 100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基的塑料袋中，机械法裂解视网膜后，用孔径为230 μm的网筛过滤，用介质冲洗后滤液再用孔径为140 μm的网筛过滤. 800 r/min离心滤液5 min后，用25 mL培养液悬浮沉淀细胞，细胞计数器测定细胞悬浮液浓度，调整细胞密度至1×108/L, 取1 mL细胞悬浮液种植于24孔培养板内经多聚赖氨酸处理的盖玻片上. 用含20 mL/L胎牛血清DMEM/F12培养基培养7~14 d后，改用各种不同实验条件下进行培养. 在进行βE2对PI3K活性和基因表达的影响实验中，根据βE2培养时间长短的不同(0,0.5,1,3,6,12 h) 分别将原代培养的细胞分为6组(每组3孔)，每次独立实验重复3次，用含10 μmol/L βE2的培养基培养细胞后，测定细胞中PI3K的活性和表达量. 在研究PI3K抑制剂LY294002对βE2保护作用的影响实验中，根据观察因素的不同将原代培养的细胞分为6组(每组3孔)，每次独立实验重复3次. 1～4组作为各种对照，5～6组作为比较LY294002对βE2影响的观察组，在各种不同因素下，分别培养细胞后，测定细胞存活率.
1.2.2MTT测定应用MTT比色法鉴定细胞的毒性作用 [6]. 用PBS配制5 g/L的MTT溶液，用去离子水配制细胞溶解缓冲液(500 g/L DMF, 200 g/L SDS, pH 4.7). 取25 μL MTT溶液加在细胞培养板孔内，37℃温育2 h后加100 μL细胞溶解缓冲液，37℃温育过夜,用酶联免疫检测仪测A562 nm值，计算细胞存活率.
1.2.3PI3K活性测定参照Kaplan等[7]方法. 50 μL反应体系中含待测样品(按总蛋白5 μg计)；200 mg/L PI4,5P2； 50 μmol ATP；7.4×103 Bq γ32pATP；5 mmol/L MgCl2和10 mmol/L HEPES缓冲液 (pH 7.5). 室温下反应15 min后，加100 μL 1 mol/L HCl终止反应. 随后加200 μL氯仿甲醇混合液(1∶1, V/V)用力混匀，离心分离脂类. 将提取的脂类样品点在硅胶60薄层层析 (thinlayer chromatography, TLC) 板上，TLC板事先用10 mg/L草酸钾和500 mL/L甲醇处理并在100℃烘箱中烘1 h. 将点有样品的TLC板放入密闭的玻璃缸中，用2丙醇和2 mol/L醋酸(63∶35，V/V) 作溶剂系统，分离产物磷脂酰肌醇3,4，5三磷酸(PI3，4,5P3). 经放射自显影后观察结果. 刮下TLC板上含有放射性脂类的硅胶进行液体闪烁计数，计算PI3K的活性.
1.2.4Western blot分析培养的视网膜神经细胞提取液经蛋白含量测定后，进行100 g/L SDSPAGE分离蛋白质. 用半干式电转仪将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素(NC)膜上，用 TTBS(100 mmol/L NaCl; 20 mmol/L TrisHCl; 1 mL/L Tween20, pH 7.4)漂洗NC膜2次，每次10 min, 经50 g/L脱脂奶粉TTBS 4℃过夜封闭后，用抗PI3K调节亚基p85抗体(1∶1000) 室温反应2 h，用TTBS洗膜3次，每次10 min, 再与HRP标记的二抗室温孵育1 h, 最后用ECL Western blotting检测试剂盒(Amersham Biosciences产品)，按照产品说明书的操作方法鉴定结果.
统计学处理: 实验数据采用x±s表示，βE2对PI3K直接作用的实验数据采用studentt检验，其他实验的组间比较采用方差分析及Dunnettt检验，方差不齐则采用KruskalWallis检验以及Wilcoxon检验，P<0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1βE2对视网膜神经细胞PI3K活性的增强作用用10 μmol/L βE2培养视网膜神经细胞30 min后，PI3K的活性开始上升，1 h后达到高峰，随后逐渐下降，12 h后恢复到正常水平(Fig1). 说明βE2能暂短的增强培养的视网膜神经细胞中PI3K的活性.
图117β雌二醇(10 μmol/L)对PI3K的激活作用 (略)
2.2βE2与PI3K的直接作用培养的视网膜神经细胞匀浆中直接加入10 μmol/L βE2的实验组与未加βE2的对照组相比, PI3K的活性无变化. 说明βE2不能直接激活匀浆中PI3K的活性. Fig 2为PI3K的产物PI3，4，5P3的TLC放射自显影图.
图2PI3K活性的TLC放射自显影 (略)
2.3βE2对视网膜神经细胞PI3K基因表达的影响用抗PI3K调节亚基p85抗体经Western blot分析发现，在不同的培养时间点下，各blot带的密度强度无明显变化，经统计学检验无差异. 说明PI3K活性的增高不是βE2通过上调细胞中PI3K的表达量所致. Fig 3表示抗PI3K调节亚基p85抗体检测PI3K表达的Western blot分析图谱.
图3PI3K调节亚基p85表达的Western blot 分析 (略)
2.4PI3K抑制剂LY294002降低了βE2的神经保护作用用特异性PI3K强抑制剂LY294002预培养细胞后再先后用βE2和 H2O2培养细胞与同样处理但未加入LY294002的实验组相比，细胞存活率显著性降低(P<0.05, Fig 4).
3讨论
我们在最近的研究中发现， H2O2对培养的视网膜神经细胞有毒性 ，能导致培养的细胞死亡. βE2能阻断H2O2对培养的视网膜神经细胞的毒性作用， 提高细胞的生存率， 对视网膜神经细胞起保护作
图4PI3K抑制剂对17β雌二醇神经保护作用的阻断 (略)
用[3]. 其作用机制并不像以往人们研究的βE2能与细胞内特异的雌激素受体相结合形成活性复合物，从而与 DNA特异部位结合，调控相关基因的表达而发挥βE2的神经保护作用[8].
我们的结果发现，βE2能显著增强细胞中PI3K的活性. βE2即不能直接与 PI3K作用，也没有影响细胞中PI3K的表达, 说明βE2对培养的视网膜神经细胞 PI3K的激活是通过某种途径间接地激活了细胞中存在的 PI3K的活性. 至于βE2通过何种途径激活PI3K的活性，还有待于进一步研究.
我们的结果发现，加入 LY294002后抑制了βE2抵御H2O2毒性保护视网膜神经细胞的作用. 其原因可能是由于 LY294002抑制了PI3K的活性，使βE2不能将PI3K激活，从而阻断了PI3K介导的信号传导途径，也阻断了βE2保护神经细胞的作用. 说明βE2的神经保护作用与 PI3K的激活有关. 近来的研究发现，一些神经营养因子可通过 PI3K的介导发挥其对神经细胞的保护作用[5]. 在某些神经细胞中也发现PI3K的激活能够保护细胞免除有害刺激导致的神经退行性变化[9] . 在视网膜对强光的研究中也发现，光能激活细胞中PI3K的活性，通过PI3K的介导激活了细胞的自我保护机制，从而保护视网膜防止强光对其造成的损伤[10]. 这些结果都说明由PI3K介导的生物效应与细胞的保护机制有密切的关系. PI3K的激活如何引发了细胞的保护机制，还有待于进一步深入研究.
【参考文献】
[1] Picazo O, Azcoitia I, GarciaSegura LM. Neuroprotective and neurotoxic effects of estrogens[J]. Brain Res, 2003；990(12):20-27.
[2] Behl C. Oestrogen as a neuroprotective hormon[J]. Nat Rev Neurosci，2002; 3(6)：433-442.
[3] 俞小瑞，高广道. 17β雌二醇对H2O2诱导视网膜神经细胞死亡的作用[J]. 西安交通大学学报(医学版)，2004；25(4) ：316-318,332.
Yu XR, Gao GD. Effects of 17βestradiol on hydrogen peroxideinduced cell death in cultured retinal neurons[J]. J Xian Jiaotong Univ (Med Sci), 2004; 25(4):316-318,332.
[4] Toth G,Yang H,Anguelov RA, et al .Gene Transfer of glial cellderived neurotrophic factor and cardiotrophin1 protects pc12 cells from injury: Involvment of the phosphatidylinositol 3kinase and mitogenactivated protein kinase kinase pathway[J]. J Neurosci Res, 2002; 69(5): 622-632.
[5] Rajala RV, Anderson RE. Interaction of the insulin receptor βSubunit with phosphatidylinositol 3kinase in bovine ROS[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002; 42(13): 3110-3117.
[6] Chang JY, Liu LZ. Toxicity of cholesterol oxides on cultured neuroretinal cell[J]. Curr Eye Res, 1998; 17(1): 95-103.
[7] Kaplan DR, Whitman M, Schaffhausen B. Common elements in growth factor stimulation and oncogenic transformation: 85 kD phosphoprotein and phosphatidylinositol kinase activity[J]. Cell, 1987; 50(7)：1021-1029.
[8] Dhandapani KM, Brann DW. Protective effects of estrogen and selective estrogen receptor modulators in the brain[J]. Biol Reprod, 2002；67(5): 1379-1385.
[9] Spear N, Estevez AG, Barbeito L, et al. Nerve growth factor protects PC12 cell against peroxynitriteinduced apoptosis via a mechanism dependent on phosphatidylinositol 3kinase[J]. J Neurochem，1997；69(1)：53-59.
[10] Rajala RV, McClellan ME, Ash JD, et al. In vivo regulation of phosphoinositide 3kinase in retina through lightinduced tyrosine phosphorylation of the insulin receptor βsubunit[J]. J Biol Chem, 2002；277(45)：43319-43326.
西安交通大学：1医学院生物化学与分子生物学教研室
2第一医院眼科
3医学院病理生理学教研室，陕西 西安 710061
4俄克拉荷马大学健康科学中心，美国 俄克拉荷马市 73104
编辑王睿, 百拇医药(俞小瑞 张小玲 高广道 曹伟)
YU XiaoRui1, ZHANG XiaoLing2, GAO GuangDao3, CAO Wei4
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, 3Department of Pathobiology, Medical College, 2Department of Ophthalmology, First Hospital, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China, 4Dean A. McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City OK. USA 73104
【Abstract】 AIM: To investigate the relationship between the retinal neuroprotective effect of βE2 and the activity of PI3K. METHODS: The relationship between the retinal neuroprotective effect of βE2 and activity of PI3K was investigated by methods of cultured retinal neurons, MTT assay, PI3K assay and Western blot analysis. RESULTS: PI3K activity was increased by a 30 min treatment of cultured retinal neurons with 10 μmol/L βE2 and reached a plateau at 1 h. The PI3K activity returned to control level after 12 h. The incubation of βE2 directly with a homogenate of cultured retinal neurons did not activate PI3K and the expression of PI3K did not respond to βE2 treatment. LY294002, a PI3K inhibitor, greatly inhibited the βE2 attenuated H2O2induced cytotoxicity. CONCLUSION: βE2 can significantly activate PI3K in cells in an indirect way and LY294002 can significantly inhibit the retinal nueroprotection provided by βE2, suggesting that neuroprotective effects of βE2 are related to the activation of PI3K.
【Keywords】 17 β estradiol; phosphatidylinositol3kinase; retina; neurons
【摘要】 目的: 研究17β雌二醇(βE2)保护视网膜神经细胞的作用与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的活性关系. 方法: 应用视网膜神经细胞培养、MTT测定、PI3K活性测定及Western blot分析的方法，观察βE2与视网膜神经细胞PI3K的关系. 结果: 10 μmol/L βE2培养细胞30 min后，PI3K的活性开始上升，1 h达高峰，12 h恢复正常. 用βE2直接与细胞匀浆37℃孵育1 h，PI3K活性没有改变. 而且βE2也未影响PI3K在细胞中的表达. PI3K抑制剂 LY294002降低了βE2削弱H2O2的毒性作用. 结论: βE2能间接激活细胞中PI3K的活性，LY294002抑制了βE2保护视网膜神经细胞的作用. 提示βE2的神经保护作用可能与PI3K的激活有关.
【关键词】 17β雌二醇；磷脂酰肌醇3激酶；视网膜; 神经细胞
0引言
近来大量研究表明17β雌二醇(17βestradiol, βE2)具有保护神经细胞、防止神经退化的作用[1，2] . 我们的研究[3]也发现βE2能削弱H2O2诱导的视网膜神经细胞的死亡，对视网膜神经细胞起保护作用. 磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3kinase, PI3K)是众多生命活动中的关键信号分子，与细胞生长、分化、迁移及死亡等的调控密切相关. 近来研究[4]发现某些神经营养因子可通过PI3K介导的信号传导途经发挥其保护神经细胞的作用. 在视网膜对光刺激的反应研究中也发现，光能激活细胞中PI3K的活性，通过PI3K介导的途经保护视网膜免遭光对其造成的损伤[5]. 为了解βE2保护视网膜神经细胞的作用是否与PI3K介导的信号传导途经有关，我们研究了PI3K的活性与βE2保护视网膜神经细胞的作用关系.
1材料和方法
1.1材料DMEM/F12培养基为GibcoBrl公司产品;γ32pATP为Perkinelmer Life Sciences产品; 磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PI4，5P2) 为Echeloreserch Laboratories公司产品;PI3K调节亚基p85抗体为Upstate Biotechnology公司产品; LY294002为Calbiochem公司产品；其他试剂均为Sigma公司产品. SD大鼠由美国俄克拉荷马大学眼科研究所实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1视网膜神经细胞的原代培养取10~15只出生48 h之内的新生SD大鼠，无菌条件下断头处死，立即剥离视网膜， PBS冲洗2～3次后将所有剥离的视网膜悬浮在含25 mL, 100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基的塑料袋中，机械法裂解视网膜后，用孔径为230 μm的网筛过滤，用介质冲洗后滤液再用孔径为140 μm的网筛过滤. 800 r/min离心滤液5 min后，用25 mL培养液悬浮沉淀细胞，细胞计数器测定细胞悬浮液浓度，调整细胞密度至1×108/L, 取1 mL细胞悬浮液种植于24孔培养板内经多聚赖氨酸处理的盖玻片上. 用含20 mL/L胎牛血清DMEM/F12培养基培养7~14 d后，改用各种不同实验条件下进行培养. 在进行βE2对PI3K活性和基因表达的影响实验中，根据βE2培养时间长短的不同(0,0.5,1,3,6,12 h) 分别将原代培养的细胞分为6组(每组3孔)，每次独立实验重复3次，用含10 μmol/L βE2的培养基培养细胞后，测定细胞中PI3K的活性和表达量. 在研究PI3K抑制剂LY294002对βE2保护作用的影响实验中，根据观察因素的不同将原代培养的细胞分为6组(每组3孔)，每次独立实验重复3次. 1～4组作为各种对照，5～6组作为比较LY294002对βE2影响的观察组，在各种不同因素下，分别培养细胞后，测定细胞存活率.
1.2.2MTT测定应用MTT比色法鉴定细胞的毒性作用 [6]. 用PBS配制5 g/L的MTT溶液，用去离子水配制细胞溶解缓冲液(500 g/L DMF, 200 g/L SDS, pH 4.7). 取25 μL MTT溶液加在细胞培养板孔内，37℃温育2 h后加100 μL细胞溶解缓冲液，37℃温育过夜,用酶联免疫检测仪测A562 nm值，计算细胞存活率.
1.2.3PI3K活性测定参照Kaplan等[7]方法. 50 μL反应体系中含待测样品(按总蛋白5 μg计)；200 mg/L PI4,5P2； 50 μmol ATP；7.4×103 Bq γ32pATP；5 mmol/L MgCl2和10 mmol/L HEPES缓冲液 (pH 7.5). 室温下反应15 min后，加100 μL 1 mol/L HCl终止反应. 随后加200 μL氯仿甲醇混合液(1∶1, V/V)用力混匀，离心分离脂类. 将提取的脂类样品点在硅胶60薄层层析 (thinlayer chromatography, TLC) 板上，TLC板事先用10 mg/L草酸钾和500 mL/L甲醇处理并在100℃烘箱中烘1 h. 将点有样品的TLC板放入密闭的玻璃缸中，用2丙醇和2 mol/L醋酸(63∶35，V/V) 作溶剂系统，分离产物磷脂酰肌醇3,4，5三磷酸(PI3，4,5P3). 经放射自显影后观察结果. 刮下TLC板上含有放射性脂类的硅胶进行液体闪烁计数，计算PI3K的活性.
1.2.4Western blot分析培养的视网膜神经细胞提取液经蛋白含量测定后，进行100 g/L SDSPAGE分离蛋白质. 用半干式电转仪将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素(NC)膜上，用 TTBS(100 mmol/L NaCl; 20 mmol/L TrisHCl; 1 mL/L Tween20, pH 7.4)漂洗NC膜2次，每次10 min, 经50 g/L脱脂奶粉TTBS 4℃过夜封闭后，用抗PI3K调节亚基p85抗体(1∶1000) 室温反应2 h，用TTBS洗膜3次，每次10 min, 再与HRP标记的二抗室温孵育1 h, 最后用ECL Western blotting检测试剂盒(Amersham Biosciences产品)，按照产品说明书的操作方法鉴定结果.
统计学处理: 实验数据采用x±s表示，βE2对PI3K直接作用的实验数据采用studentt检验，其他实验的组间比较采用方差分析及Dunnettt检验，方差不齐则采用KruskalWallis检验以及Wilcoxon检验，P<0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1βE2对视网膜神经细胞PI3K活性的增强作用用10 μmol/L βE2培养视网膜神经细胞30 min后，PI3K的活性开始上升，1 h后达到高峰，随后逐渐下降，12 h后恢复到正常水平(Fig1). 说明βE2能暂短的增强培养的视网膜神经细胞中PI3K的活性.
图117β雌二醇(10 μmol/L)对PI3K的激活作用 (略)
2.2βE2与PI3K的直接作用培养的视网膜神经细胞匀浆中直接加入10 μmol/L βE2的实验组与未加βE2的对照组相比, PI3K的活性无变化. 说明βE2不能直接激活匀浆中PI3K的活性. Fig 2为PI3K的产物PI3，4，5P3的TLC放射自显影图.
图2PI3K活性的TLC放射自显影 (略)
2.3βE2对视网膜神经细胞PI3K基因表达的影响用抗PI3K调节亚基p85抗体经Western blot分析发现，在不同的培养时间点下，各blot带的密度强度无明显变化，经统计学检验无差异. 说明PI3K活性的增高不是βE2通过上调细胞中PI3K的表达量所致. Fig 3表示抗PI3K调节亚基p85抗体检测PI3K表达的Western blot分析图谱.
图3PI3K调节亚基p85表达的Western blot 分析 (略)
2.4PI3K抑制剂LY294002降低了βE2的神经保护作用用特异性PI3K强抑制剂LY294002预培养细胞后再先后用βE2和 H2O2培养细胞与同样处理但未加入LY294002的实验组相比，细胞存活率显著性降低(P<0.05, Fig 4).
3讨论
我们在最近的研究中发现， H2O2对培养的视网膜神经细胞有毒性 ，能导致培养的细胞死亡. βE2能阻断H2O2对培养的视网膜神经细胞的毒性作用， 提高细胞的生存率， 对视网膜神经细胞起保护作
图4PI3K抑制剂对17β雌二醇神经保护作用的阻断 (略)
用[3]. 其作用机制并不像以往人们研究的βE2能与细胞内特异的雌激素受体相结合形成活性复合物，从而与 DNA特异部位结合，调控相关基因的表达而发挥βE2的神经保护作用[8].
我们的结果发现，βE2能显著增强细胞中PI3K的活性. βE2即不能直接与 PI3K作用，也没有影响细胞中PI3K的表达, 说明βE2对培养的视网膜神经细胞 PI3K的激活是通过某种途径间接地激活了细胞中存在的 PI3K的活性. 至于βE2通过何种途径激活PI3K的活性，还有待于进一步研究.
我们的结果发现，加入 LY294002后抑制了βE2抵御H2O2毒性保护视网膜神经细胞的作用. 其原因可能是由于 LY294002抑制了PI3K的活性，使βE2不能将PI3K激活，从而阻断了PI3K介导的信号传导途径，也阻断了βE2保护神经细胞的作用. 说明βE2的神经保护作用与 PI3K的激活有关. 近来的研究发现，一些神经营养因子可通过 PI3K的介导发挥其对神经细胞的保护作用[5]. 在某些神经细胞中也发现PI3K的激活能够保护细胞免除有害刺激导致的神经退行性变化[9] . 在视网膜对强光的研究中也发现，光能激活细胞中PI3K的活性，通过PI3K的介导激活了细胞的自我保护机制，从而保护视网膜防止强光对其造成的损伤[10]. 这些结果都说明由PI3K介导的生物效应与细胞的保护机制有密切的关系. PI3K的激活如何引发了细胞的保护机制，还有待于进一步深入研究.
【参考文献】
[1] Picazo O, Azcoitia I, GarciaSegura LM. Neuroprotective and neurotoxic effects of estrogens[J]. Brain Res, 2003；990(12):20-27.
[2] Behl C. Oestrogen as a neuroprotective hormon[J]. Nat Rev Neurosci，2002; 3(6)：433-442.
[3] 俞小瑞，高广道. 17β雌二醇对H2O2诱导视网膜神经细胞死亡的作用[J]. 西安交通大学学报(医学版)，2004；25(4) ：316-318,332.
Yu XR, Gao GD. Effects of 17βestradiol on hydrogen peroxideinduced cell death in cultured retinal neurons[J]. J Xian Jiaotong Univ (Med Sci), 2004; 25(4):316-318,332.
[4] Toth G,Yang H,Anguelov RA, et al .Gene Transfer of glial cellderived neurotrophic factor and cardiotrophin1 protects pc12 cells from injury: Involvment of the phosphatidylinositol 3kinase and mitogenactivated protein kinase kinase pathway[J]. J Neurosci Res, 2002; 69(5): 622-632.
[5] Rajala RV, Anderson RE. Interaction of the insulin receptor βSubunit with phosphatidylinositol 3kinase in bovine ROS[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002; 42(13): 3110-3117.
[6] Chang JY, Liu LZ. Toxicity of cholesterol oxides on cultured neuroretinal cell[J]. Curr Eye Res, 1998; 17(1): 95-103.
[7] Kaplan DR, Whitman M, Schaffhausen B. Common elements in growth factor stimulation and oncogenic transformation: 85 kD phosphoprotein and phosphatidylinositol kinase activity[J]. Cell, 1987; 50(7)：1021-1029.
[8] Dhandapani KM, Brann DW. Protective effects of estrogen and selective estrogen receptor modulators in the brain[J]. Biol Reprod, 2002；67(5): 1379-1385.
[9] Spear N, Estevez AG, Barbeito L, et al. Nerve growth factor protects PC12 cell against peroxynitriteinduced apoptosis via a mechanism dependent on phosphatidylinositol 3kinase[J]. J Neurochem，1997；69(1)：53-59.
[10] Rajala RV, McClellan ME, Ash JD, et al. In vivo regulation of phosphoinositide 3kinase in retina through lightinduced tyrosine phosphorylation of the insulin receptor βsubunit[J]. J Biol Chem, 2002；277(45)：43319-43326.
西安交通大学：1医学院生物化学与分子生物学教研室
2第一医院眼科
3医学院病理生理学教研室，陕西 西安 710061
4俄克拉荷马大学健康科学中心，美国 俄克拉荷马市 73104
编辑王睿, 百拇医药(俞小瑞 张小玲 高广道 曹伟)