五味子药材水提取工艺的优选
【摘要】 目的 优选五味子药材水提工艺。方法 用均匀设计安排试验，以五味子醇甲含量为指标，考察溶媒用量、提取次数、提取时间和浸泡时间对有效成分提取率的影响，优选出合理的提取工艺。结果 加12倍量水，浸泡7h，回流提取3次，每次1.5h。提取率为6.40%是最合理提取工艺。结论 本工艺为五味子提取工艺的改进提供参考。
【关键词】 五味子；提取工艺；均匀设计
【Abstract】 Objective To optimize the extraction process for Schisandra chinensis.Methods Uniformity design was used to arrange experiments，with the extraction efficiency of schisandrin as index. Results The optimum process was that water was used as extracting soution， decocting three times with1.5h，each time，the amount of solution 12 times，macerating 7h.The extraction efficiency was 6.40%.Conclusion The experimental results provided the basis for ascertainment of the extracting process of Schisandra chinensis.
【Key words】 schisandra chinensis;extraction;uniformity design
五味子为木兰科植物Schisandra chinensis(Turcz) Baill的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，是临床保肝降酶的首选药材。降酶灵胶囊是由五味子果仁提取加工而成的制剂，五味子醇甲(schisandrin)、五味子酯甲(schisantherin)、五味子甲素(deoxyschisandrin)及五味子乙素(r-schisandrin)等木质类成分是其重要活性成分[1]。现行标准中，184种含五味子单方及复方制剂中五味子的提取方法存在较大差异，其中39种制剂采用水煎煮法，煎煮时间不等(2～6h)。为提高有效成分得率，降低生产成本，本文采用均匀设计法安排试验，以提取物中五味子醇甲的含量为指标，考察五味子水提取工艺，为生产工艺的改进提供可靠的实验依据。
1 仪器与试药
SP-8800高效液相色谱仪，SP200紫外检测器，SP4400数据处理机(美国)。SBC-100超声波处理器(济宁市金百特电子公司提供)。五味子醇甲(批号：0857-9601，由中国药品生物制品鉴定所提供)；五味子为木兰科植物五味子Schisndra chinensis (Turcz) Baill 的干燥成熟果实；水为重蒸馏水；试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 KromasilTM C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-水(68：32)，流速1.0ml/min，检测波长224nm。定量方法：外标一点法。
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取五味子醇甲对照品12.12 mg，置50ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀，备用。精密吸取上述溶液0.3ml，置10ml棕色容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为对照品溶液。
2.3 五味子药材中五味子醇甲的含量测定 取原药材细粉约0.5g，精密称定，加正己烷30ml，回流提取3次，每次1h，滤过，合并正己烷提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解(溶解时加少量氯仿)，转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按上述方法测得原药材中五味子醇甲的含量为12.655%。
2.4 不同工艺提取液中五味子醇甲的含量测定 取五味子药材约10g，精密称定，按表2方案进行提取，合并提取液，浓缩，定容于100ml量瓶中。精密吸取25ml，用氯仿提取3次，每次30ml，合并氯仿液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，定容于25ml量瓶中，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液作为供试品溶液。吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，按上述色谱条件，测定提取液中五味子醇甲的含量。结果见表3。
3 水提工艺的优选
3.1 不同粒度对水提工艺影响 曾分别选用五味子药材最初粉、粗粉、细粉进行水提，结果最粗粉、粗粉、细粉的水煎液呈乳浊状，难以用常规方法滤过，确定以五味子药材为原料进行试验。
3.2 评价指标的选定 对水提液进行初步测定，水提液仅能提取五味子有效成分的一部分，且以五味子醇甲提取效果较好，五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的提取效果很低，未进行测定。确定以五味子醇甲为指标。
3.3 因素与水平 根据文献及预试验结果，采用均匀设计法[2]，以五味子醇甲含量为指标，以水为溶媒。对溶媒用量、提取时间、提取次数和浸泡时间4个影响得率的因素进行考察，选取水平表见表1。均匀设计表程序由JYSYSI提供。试验方案见表2。
3.4 试验安排及结果 取五味子药材约10g，精密称定，按表2方案进行提取，合并提取液，浓缩，定容于100ml量瓶中。按上述方法测定五味子醇甲的含量。每个试验重复2次，结果见表2。表1 因素水平溶媒用量(略)表2 均匀设计试验安排
3.5 回归分析 以各因素为自变量，以五味子醇甲含量为因变量，进行二项式逐步回归分析(选入剔除值、阈值均为2)，回归方程为：Y=-9.934574E-03+3.932434E-03B-1.990589 E-05B2+1.2759174 E-02AC+93598794 E-04AD (复相关系数RP=0.9999689)；其方差分析结果见表3。表3 逐步回归的方差分析注：F0.01(4，1)＝2246， P<0.05
3.6 优化处理 对目标函数进行优化计算(期望方向大好)，计算次数39029次，结果见表4。结合Y期望方向及生产实际，确定水的提取工艺条件为：加12倍量水，浸泡7h，回流提取3次，每次1.5h。表4 GLP优选结果(计算次数39029)
3.7 提取工艺条件的进一步确认 依据优选的提取工艺参数，重复2次试验测得，五味子醇甲的含量为0.812mg/g，提取率为6.4%。
4 讨论
以试验数据分析，影响五味子有效成分的提取率因素依次为溶媒用量、提取次数、提取时间、浸泡时间。从样品色谱分析看，水提取物中的有效成分色谱图与五味子果肉提取物的色谱图基本一致。优选的工艺仅能五味子中提取少量的木脂素类成分，提取率低，五味子醇甲提取率仅为6.4%。仅从提取木脂素类成分的效果看，水提取法远低于醇提法[3]。
近年来发现五味子中含有的五味子酚(schisanhenol)、丙素(wuweizhisuC)、乙素(γ-schisandrin)和甲素(deoxyschisandrin)均能明显抑制大鼠肝微粒体脂质过氧化，对自由基有保护作用，从理论上为五味子作为为滋补强壮药提供了药理学的依据[4]。这些木脂素为脂溶性成分，采用水提法不能将其有效提取出来。因此，对采用水提取法提取五味子有效成分的制剂，应进行提取工艺和药效学方面的比较，筛选出更理想的制剂工艺。
【参考文献】
1 童玉懿, 宋万志. 九种五味子的生药鉴别研究. 中草药,1982,13(2):23.
2 国家药典委员会. 中国药典(2000版)，一部. 北京: 化学工业出版社,2000，1.
3 张爱岑,李正国. 均匀设计法优选降酶灵胶囊提取工艺.中成药, 2003, 25(12):12.
4 王致谱, 蔡景峰. 中国中医药50年. 福州: 福建科学出版社, 1999,10.
作者单位：1 272045 山东济宁，济宁市药品检验所
2 272045 山东济宁，济宁市卫生局卫生监督所
(编辑：邓 锋), 百拇医药(邢军， 李正国 邢 岚)
【关键词】 五味子；提取工艺；均匀设计
【Abstract】 Objective To optimize the extraction process for Schisandra chinensis.Methods Uniformity design was used to arrange experiments，with the extraction efficiency of schisandrin as index. Results The optimum process was that water was used as extracting soution， decocting three times with1.5h，each time，the amount of solution 12 times，macerating 7h.The extraction efficiency was 6.40%.Conclusion The experimental results provided the basis for ascertainment of the extracting process of Schisandra chinensis.
【Key words】 schisandra chinensis;extraction;uniformity design
五味子为木兰科植物Schisandra chinensis(Turcz) Baill的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，是临床保肝降酶的首选药材。降酶灵胶囊是由五味子果仁提取加工而成的制剂，五味子醇甲(schisandrin)、五味子酯甲(schisantherin)、五味子甲素(deoxyschisandrin)及五味子乙素(r-schisandrin)等木质类成分是其重要活性成分[1]。现行标准中，184种含五味子单方及复方制剂中五味子的提取方法存在较大差异，其中39种制剂采用水煎煮法，煎煮时间不等(2～6h)。为提高有效成分得率，降低生产成本，本文采用均匀设计法安排试验，以提取物中五味子醇甲的含量为指标，考察五味子水提取工艺，为生产工艺的改进提供可靠的实验依据。
1 仪器与试药
SP-8800高效液相色谱仪，SP200紫外检测器，SP4400数据处理机(美国)。SBC-100超声波处理器(济宁市金百特电子公司提供)。五味子醇甲(批号：0857-9601，由中国药品生物制品鉴定所提供)；五味子为木兰科植物五味子Schisndra chinensis (Turcz) Baill 的干燥成熟果实；水为重蒸馏水；试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 KromasilTM C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈-水(68：32)，流速1.0ml/min，检测波长224nm。定量方法：外标一点法。
2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取五味子醇甲对照品12.12 mg，置50ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀，备用。精密吸取上述溶液0.3ml，置10ml棕色容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为对照品溶液。
2.3 五味子药材中五味子醇甲的含量测定 取原药材细粉约0.5g，精密称定，加正己烷30ml，回流提取3次，每次1h，滤过，合并正己烷提取液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解(溶解时加少量氯仿)，转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按上述方法测得原药材中五味子醇甲的含量为12.655%。
2.4 不同工艺提取液中五味子醇甲的含量测定 取五味子药材约10g，精密称定，按表2方案进行提取，合并提取液，浓缩，定容于100ml量瓶中。精密吸取25ml，用氯仿提取3次，每次30ml，合并氯仿液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，定容于25ml量瓶中，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液作为供试品溶液。吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，按上述色谱条件，测定提取液中五味子醇甲的含量。结果见表3。
3 水提工艺的优选
3.1 不同粒度对水提工艺影响 曾分别选用五味子药材最初粉、粗粉、细粉进行水提，结果最粗粉、粗粉、细粉的水煎液呈乳浊状，难以用常规方法滤过，确定以五味子药材为原料进行试验。
3.2 评价指标的选定 对水提液进行初步测定，水提液仅能提取五味子有效成分的一部分，且以五味子醇甲提取效果较好，五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的提取效果很低，未进行测定。确定以五味子醇甲为指标。
3.3 因素与水平 根据文献及预试验结果，采用均匀设计法[2]，以五味子醇甲含量为指标，以水为溶媒。对溶媒用量、提取时间、提取次数和浸泡时间4个影响得率的因素进行考察，选取水平表见表1。均匀设计表程序由JYSYSI提供。试验方案见表2。
3.4 试验安排及结果 取五味子药材约10g，精密称定，按表2方案进行提取，合并提取液，浓缩，定容于100ml量瓶中。按上述方法测定五味子醇甲的含量。每个试验重复2次，结果见表2。表1 因素水平溶媒用量(略)表2 均匀设计试验安排
3.5 回归分析 以各因素为自变量，以五味子醇甲含量为因变量，进行二项式逐步回归分析(选入剔除值、阈值均为2)，回归方程为：Y=-9.934574E-03+3.932434E-03B-1.990589 E-05B2+1.2759174 E-02AC+93598794 E-04AD (复相关系数RP=0.9999689)；其方差分析结果见表3。表3 逐步回归的方差分析注：F0.01(4，1)＝2246， P<0.05
3.6 优化处理 对目标函数进行优化计算(期望方向大好)，计算次数39029次，结果见表4。结合Y期望方向及生产实际，确定水的提取工艺条件为：加12倍量水，浸泡7h，回流提取3次，每次1.5h。表4 GLP优选结果(计算次数39029)
3.7 提取工艺条件的进一步确认 依据优选的提取工艺参数，重复2次试验测得，五味子醇甲的含量为0.812mg/g，提取率为6.4%。
4 讨论
以试验数据分析，影响五味子有效成分的提取率因素依次为溶媒用量、提取次数、提取时间、浸泡时间。从样品色谱分析看，水提取物中的有效成分色谱图与五味子果肉提取物的色谱图基本一致。优选的工艺仅能五味子中提取少量的木脂素类成分，提取率低，五味子醇甲提取率仅为6.4%。仅从提取木脂素类成分的效果看，水提取法远低于醇提法[3]。
近年来发现五味子中含有的五味子酚(schisanhenol)、丙素(wuweizhisuC)、乙素(γ-schisandrin)和甲素(deoxyschisandrin)均能明显抑制大鼠肝微粒体脂质过氧化，对自由基有保护作用，从理论上为五味子作为为滋补强壮药提供了药理学的依据[4]。这些木脂素为脂溶性成分，采用水提法不能将其有效提取出来。因此，对采用水提取法提取五味子有效成分的制剂，应进行提取工艺和药效学方面的比较，筛选出更理想的制剂工艺。
【参考文献】
1 童玉懿, 宋万志. 九种五味子的生药鉴别研究. 中草药,1982,13(2):23.
2 国家药典委员会. 中国药典(2000版)，一部. 北京: 化学工业出版社,2000，1.
3 张爱岑,李正国. 均匀设计法优选降酶灵胶囊提取工艺.中成药, 2003, 25(12):12.
4 王致谱, 蔡景峰. 中国中医药50年. 福州: 福建科学出版社, 1999,10.
作者单位：1 272045 山东济宁，济宁市药品检验所
2 272045 山东济宁，济宁市卫生局卫生监督所
(编辑：邓 锋), 百拇医药(邢军， 李正国 邢 岚)