靶向Survivin的siRNA诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究
关键词：RNA干扰；Survivin；胰腺癌
摘要：目的 采用RNA干扰技术阻断Survivin 基因的表达，观察其抑制胰腺癌细胞增殖及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。 方法 构建靶向Survivin的siRNA质粒表达载体，采用lipofectamineTM2000转染胰腺癌细胞PC-2，采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞Survivin 基因表达的变化；采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制作用；采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡的作用。 结果 靶向Survivin的序列特异性的siRNA可以高效地抑制PC-2细胞Survivin基因的表达，在mRNA水平其表达抑制率为81.25%，在蛋白质水平其表达抑制率为74.24%。转染靶向Survivin的siRNA质粒表达载体可以显著抑制PC-2细胞的增殖，细胞接种24、48 h后其增殖抑制率分别为28.00%和33.38%；转染后24、48 h可以诱导8.46%、7.53%的细胞凋亡。 结论 所构建的靶向Survivin的siRNA质粒表达载体可以有效地阻断PC-2细胞Survivin 基因的表达，阻断Survivin 基因的表达可以显著地抑制PC-2细胞的增殖并在一定程度上诱导其凋亡，靶向Survivin的RNA干扰技术在胰腺癌的基因治疗中具有一定的价值。
siRNA targeted against survivin induces apoptosis of pancreatic cancer cells
GUAN Hai-tao1, XUE Xing-huan1, WANG Xi-jing1, LI Ang2, QIN Zhao-yin3
Department of Oncologic Surgery1, Department of General Surgery3, Second Hospital of Xi’an Jiaotong University; 2Medical Research Center, Stomatological Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China
Abstract: Objective To investigate the effect of a sequence-specific small interfering RNA (siRNA) in suppressing survivin expression and cell proliferation and inducing apoptosis of PC-2 cells. Methods The plasmid expression vector of siRNA targeted against survivin was constructed and transfected into PC-2 cells with lipofectamineTM2000. The changes of survivin expression were detected by semi-quantitative RT-PCR and immunohistochemical SP methods. The effect of siRNA in suppressing the proliferation of PC-2 cells was detected by MTT assay, and its effect in inducing PC-2 cell apoptosis evaluated by flow cytometry. Results The sequence-specific siRNA effectively suppressed survivin expression at both mRNA and protein levels with inhibition rate of 81.25% at mRNA level and 74.24% at protein level. Survivin expression suppression significantly inhibited the proliferation of PC-2 cells, and at 24 and 48 h after cell seeding, the proliferation inhibition rate was 28.00% and 33.38% respectively; 24, 48 h after the transfection, apoptosis occurred in 8.46% and 7.53% of the cells, respectively. Conclusions The plasmid expression vector for the siRNA against survivin constructed in the study can effectively and specifically suppress survivin expression in PC-2 cells, and blocking survivin expression suppresses PC-2 cell proliferation and induces cell apoptosis. siRNA targeted against survivin has potential value in gene therapy for pancreatic cancer.
Key words: RNA interference; survivin; pancreatic cancer
Survivin基因是于1997年发现的凋亡抑制蛋白家族成员之一，具有抗凋亡和调节细胞周期的双重功能。Survivin的表达具有高度的特异性，在多数肿瘤组织中存在着过表达，而在大多数正常组织中不表达，是肿瘤基因治疗的理想靶点。RNA干扰(RNAi)是双链RNA介导的转录后基因沉默，具有高度的特异性和有效性，正成为基因功能研究的有力工具。因此我们构建了靶向Survivin的小干扰RNA(siRNA)质粒表达载体并转染胰腺癌PC-2细胞，观察其抑制PC-2细胞增殖及诱导其凋亡的作用。
1 材料和方法
1.1 胰腺癌细胞株和培养
胰腺癌细胞株PC-2购自第四军医大学动物实验中心，为贴壁细胞。采用含100 ml/L小牛血清、1×105 U/L青霉素、0.1 g/L链霉素的RPMI 1640培养基在37 ℃、50 ml/L CO2、饱和湿度的条件下传代培养。
1.2 靶向Survivin的siRNA质粒表达载体的构建
质粒Pgenesil-1购自武汉晶赛生物工程技术有限公司。用BamHI、HindIII双酶切使其线性化，1%低熔点琼脂糖凝胶回收大片段。针对目的基因Survivin的序列5、-GGA CCA CCG CAT CTC TAC A-3[1]设计两条DNA链，1条为：5-GATCC GGA CCA CCG CAT CTC TAC A TTCAAGACG TGT AGA GAT GCG GTG GTC C TTTTTT GAATTC A-3、；另1条为3-GCCT GGT GGC GTA GAG ATG T AAGTTCTGC ACA TCT CTA CGC CAC CAG G AAAAAA CTTAAG TTCGA-5、，DNA链的结构为BamHI+正义链+环状结构+反义链+中止信号+EcoRI +HindIII。上述两条DNA链退火并磷酸化后与线性化质粒载体Pgenesil-1连接。取连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布于含0.05 g/L卡那霉素的固体LB平板上，37 ℃恒温培养过夜。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3 ml含0.05 g/L卡那霉素的LB液体培养液中，37 ℃恒温摇床培养过夜。提取质粒并酶切鉴定、测序。所得质粒命名为Pgenesil-sur(+)。同法构建阴性对照质粒命名为Pgenesil-sur(-)，其靶序列为：5-GAC TTC ATA AGG CGC ATG C-3、，该序列与人、鼠无同源性。两条DNA链的序列为：5-GATCC GAC TTC ATA AGG CGC ATG C TTCAAGACG GCA TGC GCC TTA TGA AGT C TTTTTT GTCGAC A-3和3-G CTG AAG TAT TCC GCG TAC G AAGTTCTGC CGT ACG CGG AAT ACT TCA G AAAAAA CAGCTG TTCGA-5，其结构为BamHI+正义链+环状结构+反义链+中止信号+ SalI +HindIII。
1.3 质粒的提取
中量无内毒素质粒提取试剂盒购自北京天为时代公司，按试剂盒操作说明提取质粒，紫外分光光度计测定其浓度和纯度，-20 ℃保存备用。
1.4 PC-2细胞的转染
以24孔细胞培养板为例。转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。常规消化收集细胞后，将细胞接种于24孔培养板。转染前1天换用不含抗生素、含有血清的培养基。待细胞生长至密度为70%~80%时，进行转染。用不含抗生素和血清的培养基将质粒0.8 μg、LipofectamineTM2000 2.4 μl分别稀释至50 μl，混匀后室温放置5 min，然后将二者混合均匀，室温放置20 min后加入培养孔中。多孔转染，按上述比例批量制作转染混合物后进行转染。转染后6 h，换用普通完全培养基，12 h后于倒置荧光显微镜下观察细胞表达增强绿色荧光蛋白的情况。
1.5 半定量RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达的变化
细胞接种于6 cm培养皿，分为3组：(1)空白对照组；(2)阴性对照组；(3)阳性实验组，每组3个培养皿。空白对照组转染时仅加入LipofectamineTM2000；阴性对照组转染时使用Pgenesil-sur(-)质粒；阳性实验组转染时使用Pgenesil-sur(+)质粒。转染后24 h消化收集1×106个细胞，按Trizol试剂说明书提取总RNA。紫外分光光度计测定其浓度和纯度。RT-PCR反应采用两步法。(1)cDNA的合成：采用RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒，取1 μg总RNA，按操作说明书合成cDNA；(2)PCR反应：采用北京天为时代公司的一管便捷式PCR反应试剂盒。内参照GAPDH的引物序列采用国际标准序列：5-CGA AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3(上游引物)；5-AGC CTT CTC GGT GGT GAA GAC-3(下游引物)，扩增产物大小为306 bp。Survivin的引物序列为：5-GCA TGG GTG CCC CGA CGT TG-3(上游引物)；5-GCT CCG GCC AGA GGC CTC AA-3(下游引物)，扩增产物大小为447 bp。用凝胶成像分析仪进行摄像，用Dolphin 1D软件进行半定量分析。Survivin基因的表达强度用Survivin基因RT-PCR反应产物的光密度与内参照GAPDH RT-PCR反应产物光密度的比值表示。按以下公式计算Survivin基因表达的抑制率：Survivin基因表达的抑制率=(1-观察组Survivin表达强度/对照组Survivin表达强度)×100%。
1.6 免疫组化法检测Survivin基因蛋白表达的变化
将细胞接种于置入了细胞爬片的24孔培养板中进行转染。分组及转染同1.5，每组8孔。转染后24 h用65%的丙酮固定细胞，免疫组化SP法检测Survivin蛋白的表达。一抗为兔抗人单克隆抗体，购自北京中山公司，工作浓度为1:50。阳性对照为已知Survivin表达阳性的乳腺癌石蜡切片；用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。阳性表达为胞质或胞核出现棕黄色颗粒。根据细胞着色的深浅将Survivin基因的表达强度分为：(1)阴性，细胞不着色，记0分；(2)弱阳性， 细胞呈淡黄色，记1分；(3)阳性，细胞呈棕黄色，记2分；(4)强阳性，细胞呈深棕黄色，记3分。每张爬片于高倍镜下随机观察5个视野，计数细胞并对每个细胞进行评分，最后将评分之和除以细胞总数，所得数值作为该张细胞爬片Survivin的表达强度。按1.5中的公式计算Survivin基因表达的抑制率。
1.7 MTT法检测对胰腺癌细胞增殖的抑制作用
将细胞接种于6孔培养板中并进行转染，分组及转染同1.5。12 h后消化、收集细胞，调整细胞浓度为1×107个/L，分别将各组细胞接种于96孔培养板，每组8孔，每孔200 μl。另设对照孔调零，每个检测时间点接种1板，共3板。于细胞接种后0、24、48 h采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制率：增殖的抑制率=(1-观察组A490值/对照组A490值)×100%。
1.8 流式细胞术检测细胞凋亡
采用PI单染法检测PC-2细胞凋亡。细胞接种于6孔培养板，分组及转染同1.5，每组6孔。分别于转染后24、48 h消化收集细胞，每次每组各取3孔细胞。PBS缓冲液洗两遍，用预冷的75%乙醇固定过夜。1000 r/imi、5 min离心，倾去上清液，PBS缓冲液洗两遍，加入0.05 g/L的RNAse，室温避光30 min，去除细胞内RNA。加入0.06 g/L的PI，室温避光30 min后上机检测。
1.9 统计学处理
应用统计学软件SPSS10.0进行统计分析，多组间均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA)。
2 结果
2.1 质粒的酶切鉴定和测序结果
质粒Pgenesil-1的多克隆酶切位点如下：HindIII-XbaI-SalI-PstI-BamHI-U6 Promotor-EcoRI-SalI-XbaI-DraIII。在插入的目的基因片段里，我们设计了一个EcoRI的酶切位点[Pgenesil-sur(+)质粒]或SalI的酶切位点[Pgenesil-sur(-)质粒]，插入在质粒Pgenesil-1的BamHI和HindIII之间。若插入正确，就能被EcoRI或SalI酶切出一条约400 bp的小带。经酶切分析Pgenesil-sur(+)、Pgenesil-sur(-)均符合设计要求。送转化菌液去上海博亚生物公司测序，经测序结果(图1)符合设计要求。
bp 1 2 3 4 bp
10000bp
7500bp
5000bp
2500bp
1000bp
250bp
2500bp
2000bp
1500bp
1000bp
500bp
300bp
图1 质粒酶切鉴定凝胶电泳图
Fig.l Verification of the plasmids digested with restriction endonuclease
Lane 1: MarkerVII; Lane 2: MarkerVI; Lane 3: Pgenesil-sur(+); Lane 4: Pgenesil-sur(-)
2.2 PC-2细胞的转染结果
PC-2细胞转染Pgenesil-sur(+)质粒或Pgenesil-sur(-)质粒12 h后，于倒置荧光显微镜下观察可见到有增强绿色荧光蛋白的表达，24 h左右表达最强，72 h后增强绿色荧光蛋白的表达逐渐减弱(图2、3)。
图2 PC-2细胞转染Pgenesil-sur(+)质粒24 h后增强绿色荧光蛋白表达情况(×200)
Fig.2 Expression of EGFP in PC-2 cells 24 h after transfection with plasmid Pgenesil-sur(+) (×200)
图3 PC-2细胞转染Pgenesil-sur(-)质粒24 h后增强绿色荧光蛋白表达情况(×200)
Fig.3 Expression of EGFP in PC-2 cells 24 h after transfection with plasmid Pgenesil-sur(-) (×200)
2.3 半定量RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达的变化
转染后24 h，空白对照组、阴性对照组、阳性实验组Survivin mRNA的表达强度(图4)分别为0.96±0.02、0.98±0.03和0.18±0.03，统计分析表明PC-2细胞转染Pgenesil-sur(+)质粒后，Survivin的表达被显著抑制(P<0.05)，其抑制率达到81.25%；转染Pgenesil-sur(-)质粒对PC-2细胞Survivin表达则无抑制作用(P>0.05)。
Survivin
GADPH
600bp
500bp
300bp
200bp
100bp
bp 1 2 3 4
图4 半定量RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达变化的凝胶电泳图
Fig.4 Expression of survivin mRNA detected by semi-quantitative RT-PCR
Lane 1: Blank control group; Lane 2: Negative control group; Lane 3: Marker I; Lane 4: Positive experiment group
2.4 免疫组化法检测Survivin基因蛋白表达的变化
转染后24 h，空白对照组、阴性对照组、阳性实验组Survivin蛋白的表达强度(图5)分别为2.29±0.23、2.34±0.15和0.59±0.16，统计分析表明PC-2细胞转染Pgenesil-sur(+)质粒后，Survivin蛋白的表达被显著抑制(P<0.05)，其抑制率达到74.24%；转染Pgenesil-sur(-)质粒对PC-2细胞Survivin蛋白的表达则无抑制作用(P>0.05)。
图5 不同组Survivin表达情况(免疫组化SP法，DAB显色，×400)
Fig.5 Immunohistochemistry for survivin expression in different groups (SP methods, ×400)
A: Blank control group; B: Negative control group; C: Positive experiment group
2.5 MTT法检测对胰腺癌细胞增殖的抑制作用
MTT法检测结果表明转染Pgenesil-sur(+)质粒后可显著抑制PC-2细胞的增殖，细胞接种后24、48 h的增殖抑制率分别为28.00%和33.38% (P<0.05)。转染Pgenesil-sur(-)质粒对PC-2细胞的增殖无影响(P>0.05)。
2.6 流式细胞术检测PC-2细胞的凋亡
转染后24、48 h，空白对照组、阴性对照组均未检测到细胞凋亡，阳性实验组细胞24、48 h的凋亡率分别为((8.46±1.07)%和(7.53±0.93)%。统计结果表明转染Pgenesil-sur(+)质粒后PC-2细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)，但阳性实验组细胞24、48 h的细胞凋亡率差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
胰腺癌是预后最差的恶性肿瘤之一，手术或化疗后的5年生存率仅为1%~2%。胰腺癌细胞对凋亡的抵抗导致胰腺癌对大多数的抗肿瘤治疗如放疗、化疗、免疫治疗不敏感，这是胰腺癌预后极差的重要原因之一[2]。近年来的研究证实Survivin与恶性肿瘤的关系密切，Survivin在大多数肿瘤组织中存在着高表达，且与肿瘤的发生、发展，与血管形成，与肿瘤的化疗敏感性、放射敏感性以及复发、预后等密切相关， 阻断Survivin基因的表达，可以诱导肿瘤细胞的凋亡，提高肿瘤细胞对化疗药物和放疗的敏感性，抑制肿瘤血管形成[3-4]。对Survivin与胰腺癌关系的研究表明，Survivin在胰腺癌中也存在着过表达，并通过抑制细胞凋亡参与胰腺癌的发生、发展；Survivin与胰腺癌放疗、化疗敏感性相关，是胰腺癌预后的指标[5~8]。这些研究提示Survivin在胰腺癌的基因治疗中具有潜在的重要价值。
目前认为Survivin抑制细胞凋亡的机制可能为：(1)直接或间接抑制caspases(caspase-3、caspase-7、caspase-6、caspase-8、caspase-9、caspase-10)的活性；(2)与cdk4/P21复合物相互作用，释放出P21，P21再与caspase-3结合；(3)与Smac/DIABLO(Second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP binding protein with low Pi)结合并将其隔离，防止Smac/DIABLO与其他的凋亡抑制蛋白结合。对Survivin在细胞分裂过程中定位的研究表明，Survivin与INCENP(inner centromere protein)、Aurora-B等共同在调节细胞周期、细胞分裂的过程中扮演了重要角色。阻断Survivin的表达，可以破坏微管的形成，导致多倍体的形成和细胞分裂失败[9]。
RNAi是自然界生物体的一种遗传现象，是一种由双链RNA介导的序列特异性的转录后的基因沉默过程。当外源性的双链RNA进入细胞后，被RNAseIII蛋白家族成员之一的Dicer酶所识别并被切割为21~23个核苷酸的短的双链RNA，即小干扰RNA (siRNA)。siRNA与RNA介导的沉默复合体结合后，识别并降解同源的mRNA，从而特异性地抑制目的基因的表达[10]，具有高效、特异、低毒的特点。自发现以来，siRNA已广泛应用于基因功能、肿瘤和病毒性疾病治疗等的研究。本实验中，我们参考Kappler 等[1]的序列，设计构建了靶向Survivin的siRNA质粒表达载体，其转录产物可在体内形成由1个茎环所分离的具有反向重复序列的发卡样RNA，此RNA随后被加工成siRNA而降解靶基因mRNA，达到阻断靶基因表达的目的。本实验中所构建的siRNA质粒表达载体中含有增强的绿色荧光蛋白，可以方便地观察到转染的效果。进行RNAi研究时，目的基因靶序列的选择至关重要，针对不同的靶序列干扰的效果可能相差甚远[11]。本实验所参考Kappler等[1]的序列已证实对多种肿瘤细胞有效[12]。我们的实验亦证实该序列对胰腺癌、乳腺癌有效(另文发表)，提示该序列可能具有通用性，可以作为研究靶向Survivin的RNAi时的优先考虑的序列。我们采用免疫组化技术来检测Survivin在蛋白质水平的表达变化有一个显著的优点，即在同一张细胞爬片上本身就存在着自身对照(转染成功的细胞和未转染的的细胞)，可以直观地看到RNAi的效果。
RT-PCR和免疫组化检测结果表明，本实验中所构建的靶向Survivin的siRNA质粒表达载体具有高度特异性，可以有效地抑制PC-2细胞Survivin的表达。抑制PC-2细胞Survivin基因的表达可以显著抑制PC-2细胞的增殖并诱发一定程度的自发调亡，提示靶向Survivin的siRNA在胰腺癌的治疗中具有一定的价值，为今后进一步研究提供了必要的实验基础。
参考文献：
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[3] Yamamoto T, Tanigawa N. The role of survivin as a new target of diagnosis and treatment in human cancer [J]. Med Electron Microsc, 2001, 34(4): 207-12.
[4] Coma S, Noe V, Lavarino C, et al. Use of siRNAs and antisense oligonucleotides against survivin RNA to inhibit steps leading to tumorangiogenesis[J]. Oligonucleotides, 2004, 14(2): 100-13.
[5] Satoh K, Kaneko K, Hirota M, et al. Expression of survivin is correlated with cancer cell apoptosis and is involved in the development of human pancreatic duct cell tumors[J]. Cancer, 2001, 92(2): 271-8.
[6] Asanuma K, Kobayashi D, Furuya D, et al. A role for survivin in radioresistance of pancreatic cancer cells[J]. Jpn J Cancer Res, 2002, 93(9): 1057-62.
[7] Kami K, Doi R, Koizumi M, et al. Survivin expression is a prognostic marker in pancreatic cancer patients [J]. Surgery, 2004, 136(2): 443-8.
[8] 刘江伟, 李开宗, 窦科峰, 等. Survivin反义寡核苷酸诱导胰腺癌细胞凋亡并增加吉西他滨的化疗敏感性[J]. 中华普通外科杂志, 2004, 19(7): 401-3.
Liu JW, Li KZ, Dou KF, et al. Survivin antisense oligonucleotide induces apoptosis and sensitizes pancreatic cancer cells to Gemcitabine[J]. Chin J Gen Surg, 2004, 19(7): 401-3.
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[11] Luo KQ, Chang DC. The gene-silencing effciency of siRNA is strongly dependent on the local structure of mRNA at the targeted region[J]. Bioche Biophy Res Commun, 2004, 318(1): 303-10.
[12] 卢 昕, 郑启昌, 熊 俊, 等. siRNA抑制肝癌细胞株HepG2 survivin基因表达的研究[J]. 华中科技大学学报(医学版), 2004, 33(6): 696-9.
Lu X, Zheng QC, Xiong J, et al. Inhibitory effect of siRNA on Survivin expression in HepG2 cells[J]. J Huazhong Univ Sci Tech (Health Sci), 2004, 33(6): 696-9.
基金项目：陕西省科技攻关项目[2004K13-G11(1)]
Supported by the Key Science and Technology Research Project of Shaanxi Province [2004K13-G11(1)]
作者简介：管海涛(1971-)，男，在读博士研究生，主治医师
(西安交通大学第二医院1肿瘤外科，3普通外科，陕西 西安710004；2西安交通大学口腔医院医学研究中心，陕西 西安710004), 百拇医药(管海涛1，薛兴欢1，王西京1，李 昂2 ，秦兆寅3)
摘要：目的 采用RNA干扰技术阻断Survivin 基因的表达，观察其抑制胰腺癌细胞增殖及诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。 方法 构建靶向Survivin的siRNA质粒表达载体，采用lipofectamineTM2000转染胰腺癌细胞PC-2，采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞Survivin 基因表达的变化；采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制作用；采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡的作用。 结果 靶向Survivin的序列特异性的siRNA可以高效地抑制PC-2细胞Survivin基因的表达，在mRNA水平其表达抑制率为81.25%，在蛋白质水平其表达抑制率为74.24%。转染靶向Survivin的siRNA质粒表达载体可以显著抑制PC-2细胞的增殖，细胞接种24、48 h后其增殖抑制率分别为28.00%和33.38%；转染后24、48 h可以诱导8.46%、7.53%的细胞凋亡。 结论 所构建的靶向Survivin的siRNA质粒表达载体可以有效地阻断PC-2细胞Survivin 基因的表达，阻断Survivin 基因的表达可以显著地抑制PC-2细胞的增殖并在一定程度上诱导其凋亡，靶向Survivin的RNA干扰技术在胰腺癌的基因治疗中具有一定的价值。
siRNA targeted against survivin induces apoptosis of pancreatic cancer cells
GUAN Hai-tao1, XUE Xing-huan1, WANG Xi-jing1, LI Ang2, QIN Zhao-yin3
Department of Oncologic Surgery1, Department of General Surgery3, Second Hospital of Xi’an Jiaotong University; 2Medical Research Center, Stomatological Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China
Abstract: Objective To investigate the effect of a sequence-specific small interfering RNA (siRNA) in suppressing survivin expression and cell proliferation and inducing apoptosis of PC-2 cells. Methods The plasmid expression vector of siRNA targeted against survivin was constructed and transfected into PC-2 cells with lipofectamineTM2000. The changes of survivin expression were detected by semi-quantitative RT-PCR and immunohistochemical SP methods. The effect of siRNA in suppressing the proliferation of PC-2 cells was detected by MTT assay, and its effect in inducing PC-2 cell apoptosis evaluated by flow cytometry. Results The sequence-specific siRNA effectively suppressed survivin expression at both mRNA and protein levels with inhibition rate of 81.25% at mRNA level and 74.24% at protein level. Survivin expression suppression significantly inhibited the proliferation of PC-2 cells, and at 24 and 48 h after cell seeding, the proliferation inhibition rate was 28.00% and 33.38% respectively; 24, 48 h after the transfection, apoptosis occurred in 8.46% and 7.53% of the cells, respectively. Conclusions The plasmid expression vector for the siRNA against survivin constructed in the study can effectively and specifically suppress survivin expression in PC-2 cells, and blocking survivin expression suppresses PC-2 cell proliferation and induces cell apoptosis. siRNA targeted against survivin has potential value in gene therapy for pancreatic cancer.
Key words: RNA interference; survivin; pancreatic cancer
Survivin基因是于1997年发现的凋亡抑制蛋白家族成员之一，具有抗凋亡和调节细胞周期的双重功能。Survivin的表达具有高度的特异性，在多数肿瘤组织中存在着过表达，而在大多数正常组织中不表达，是肿瘤基因治疗的理想靶点。RNA干扰(RNAi)是双链RNA介导的转录后基因沉默，具有高度的特异性和有效性，正成为基因功能研究的有力工具。因此我们构建了靶向Survivin的小干扰RNA(siRNA)质粒表达载体并转染胰腺癌PC-2细胞，观察其抑制PC-2细胞增殖及诱导其凋亡的作用。
1 材料和方法
1.1 胰腺癌细胞株和培养
胰腺癌细胞株PC-2购自第四军医大学动物实验中心，为贴壁细胞。采用含100 ml/L小牛血清、1×105 U/L青霉素、0.1 g/L链霉素的RPMI 1640培养基在37 ℃、50 ml/L CO2、饱和湿度的条件下传代培养。
1.2 靶向Survivin的siRNA质粒表达载体的构建
质粒Pgenesil-1购自武汉晶赛生物工程技术有限公司。用BamHI、HindIII双酶切使其线性化，1%低熔点琼脂糖凝胶回收大片段。针对目的基因Survivin的序列5、-GGA CCA CCG CAT CTC TAC A-3[1]设计两条DNA链，1条为：5-GATCC GGA CCA CCG CAT CTC TAC A TTCAAGACG TGT AGA GAT GCG GTG GTC C TTTTTT GAATTC A-3、；另1条为3-GCCT GGT GGC GTA GAG ATG T AAGTTCTGC ACA TCT CTA CGC CAC CAG G AAAAAA CTTAAG TTCGA-5、，DNA链的结构为BamHI+正义链+环状结构+反义链+中止信号+EcoRI +HindIII。上述两条DNA链退火并磷酸化后与线性化质粒载体Pgenesil-1连接。取连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布于含0.05 g/L卡那霉素的固体LB平板上，37 ℃恒温培养过夜。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3 ml含0.05 g/L卡那霉素的LB液体培养液中，37 ℃恒温摇床培养过夜。提取质粒并酶切鉴定、测序。所得质粒命名为Pgenesil-sur(+)。同法构建阴性对照质粒命名为Pgenesil-sur(-)，其靶序列为：5-GAC TTC ATA AGG CGC ATG C-3、，该序列与人、鼠无同源性。两条DNA链的序列为：5-GATCC GAC TTC ATA AGG CGC ATG C TTCAAGACG GCA TGC GCC TTA TGA AGT C TTTTTT GTCGAC A-3和3-G CTG AAG TAT TCC GCG TAC G AAGTTCTGC CGT ACG CGG AAT ACT TCA G AAAAAA CAGCTG TTCGA-5，其结构为BamHI+正义链+环状结构+反义链+中止信号+ SalI +HindIII。
1.3 质粒的提取
中量无内毒素质粒提取试剂盒购自北京天为时代公司，按试剂盒操作说明提取质粒，紫外分光光度计测定其浓度和纯度，-20 ℃保存备用。
1.4 PC-2细胞的转染
以24孔细胞培养板为例。转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。常规消化收集细胞后，将细胞接种于24孔培养板。转染前1天换用不含抗生素、含有血清的培养基。待细胞生长至密度为70%~80%时，进行转染。用不含抗生素和血清的培养基将质粒0.8 μg、LipofectamineTM2000 2.4 μl分别稀释至50 μl，混匀后室温放置5 min，然后将二者混合均匀，室温放置20 min后加入培养孔中。多孔转染，按上述比例批量制作转染混合物后进行转染。转染后6 h，换用普通完全培养基，12 h后于倒置荧光显微镜下观察细胞表达增强绿色荧光蛋白的情况。
1.5 半定量RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达的变化
细胞接种于6 cm培养皿，分为3组：(1)空白对照组；(2)阴性对照组；(3)阳性实验组，每组3个培养皿。空白对照组转染时仅加入LipofectamineTM2000；阴性对照组转染时使用Pgenesil-sur(-)质粒；阳性实验组转染时使用Pgenesil-sur(+)质粒。转染后24 h消化收集1×106个细胞，按Trizol试剂说明书提取总RNA。紫外分光光度计测定其浓度和纯度。RT-PCR反应采用两步法。(1)cDNA的合成：采用RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒，取1 μg总RNA，按操作说明书合成cDNA；(2)PCR反应：采用北京天为时代公司的一管便捷式PCR反应试剂盒。内参照GAPDH的引物序列采用国际标准序列：5-CGA AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3(上游引物)；5-AGC CTT CTC GGT GGT GAA GAC-3(下游引物)，扩增产物大小为306 bp。Survivin的引物序列为：5-GCA TGG GTG CCC CGA CGT TG-3(上游引物)；5-GCT CCG GCC AGA GGC CTC AA-3(下游引物)，扩增产物大小为447 bp。用凝胶成像分析仪进行摄像，用Dolphin 1D软件进行半定量分析。Survivin基因的表达强度用Survivin基因RT-PCR反应产物的光密度与内参照GAPDH RT-PCR反应产物光密度的比值表示。按以下公式计算Survivin基因表达的抑制率：Survivin基因表达的抑制率=(1-观察组Survivin表达强度/对照组Survivin表达强度)×100%。
1.6 免疫组化法检测Survivin基因蛋白表达的变化
将细胞接种于置入了细胞爬片的24孔培养板中进行转染。分组及转染同1.5，每组8孔。转染后24 h用65%的丙酮固定细胞，免疫组化SP法检测Survivin蛋白的表达。一抗为兔抗人单克隆抗体，购自北京中山公司，工作浓度为1:50。阳性对照为已知Survivin表达阳性的乳腺癌石蜡切片；用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。阳性表达为胞质或胞核出现棕黄色颗粒。根据细胞着色的深浅将Survivin基因的表达强度分为：(1)阴性，细胞不着色，记0分；(2)弱阳性， 细胞呈淡黄色，记1分；(3)阳性，细胞呈棕黄色，记2分；(4)强阳性，细胞呈深棕黄色，记3分。每张爬片于高倍镜下随机观察5个视野，计数细胞并对每个细胞进行评分，最后将评分之和除以细胞总数，所得数值作为该张细胞爬片Survivin的表达强度。按1.5中的公式计算Survivin基因表达的抑制率。
1.7 MTT法检测对胰腺癌细胞增殖的抑制作用
将细胞接种于6孔培养板中并进行转染，分组及转染同1.5。12 h后消化、收集细胞，调整细胞浓度为1×107个/L，分别将各组细胞接种于96孔培养板，每组8孔，每孔200 μl。另设对照孔调零，每个检测时间点接种1板，共3板。于细胞接种后0、24、48 h采用MTT法检测对PC-2细胞增殖的抑制率：增殖的抑制率=(1-观察组A490值/对照组A490值)×100%。
1.8 流式细胞术检测细胞凋亡
采用PI单染法检测PC-2细胞凋亡。细胞接种于6孔培养板，分组及转染同1.5，每组6孔。分别于转染后24、48 h消化收集细胞，每次每组各取3孔细胞。PBS缓冲液洗两遍，用预冷的75%乙醇固定过夜。1000 r/imi、5 min离心，倾去上清液，PBS缓冲液洗两遍，加入0.05 g/L的RNAse，室温避光30 min，去除细胞内RNA。加入0.06 g/L的PI，室温避光30 min后上机检测。
1.9 统计学处理
应用统计学软件SPSS10.0进行统计分析，多组间均数比较采用单向方差分析(One-way ANOVA)。
2 结果
2.1 质粒的酶切鉴定和测序结果
质粒Pgenesil-1的多克隆酶切位点如下：HindIII-XbaI-SalI-PstI-BamHI-U6 Promotor-EcoRI-SalI-XbaI-DraIII。在插入的目的基因片段里，我们设计了一个EcoRI的酶切位点[Pgenesil-sur(+)质粒]或SalI的酶切位点[Pgenesil-sur(-)质粒]，插入在质粒Pgenesil-1的BamHI和HindIII之间。若插入正确，就能被EcoRI或SalI酶切出一条约400 bp的小带。经酶切分析Pgenesil-sur(+)、Pgenesil-sur(-)均符合设计要求。送转化菌液去上海博亚生物公司测序，经测序结果(图1)符合设计要求。
bp 1 2 3 4 bp
10000bp
7500bp
5000bp
2500bp
1000bp
250bp
2500bp
2000bp
1500bp
1000bp
500bp
300bp
图1 质粒酶切鉴定凝胶电泳图
Fig.l Verification of the plasmids digested with restriction endonuclease
Lane 1: MarkerVII; Lane 2: MarkerVI; Lane 3: Pgenesil-sur(+); Lane 4: Pgenesil-sur(-)
2.2 PC-2细胞的转染结果
PC-2细胞转染Pgenesil-sur(+)质粒或Pgenesil-sur(-)质粒12 h后，于倒置荧光显微镜下观察可见到有增强绿色荧光蛋白的表达，24 h左右表达最强，72 h后增强绿色荧光蛋白的表达逐渐减弱(图2、3)。
图2 PC-2细胞转染Pgenesil-sur(+)质粒24 h后增强绿色荧光蛋白表达情况(×200)
Fig.2 Expression of EGFP in PC-2 cells 24 h after transfection with plasmid Pgenesil-sur(+) (×200)
图3 PC-2细胞转染Pgenesil-sur(-)质粒24 h后增强绿色荧光蛋白表达情况(×200)
Fig.3 Expression of EGFP in PC-2 cells 24 h after transfection with plasmid Pgenesil-sur(-) (×200)
2.3 半定量RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达的变化
转染后24 h，空白对照组、阴性对照组、阳性实验组Survivin mRNA的表达强度(图4)分别为0.96±0.02、0.98±0.03和0.18±0.03，统计分析表明PC-2细胞转染Pgenesil-sur(+)质粒后，Survivin的表达被显著抑制(P<0.05)，其抑制率达到81.25%；转染Pgenesil-sur(-)质粒对PC-2细胞Survivin表达则无抑制作用(P>0.05)。
Survivin
GADPH
600bp
500bp
300bp
200bp
100bp
bp 1 2 3 4
图4 半定量RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达变化的凝胶电泳图
Fig.4 Expression of survivin mRNA detected by semi-quantitative RT-PCR
Lane 1: Blank control group; Lane 2: Negative control group; Lane 3: Marker I; Lane 4: Positive experiment group
2.4 免疫组化法检测Survivin基因蛋白表达的变化
转染后24 h，空白对照组、阴性对照组、阳性实验组Survivin蛋白的表达强度(图5)分别为2.29±0.23、2.34±0.15和0.59±0.16，统计分析表明PC-2细胞转染Pgenesil-sur(+)质粒后，Survivin蛋白的表达被显著抑制(P<0.05)，其抑制率达到74.24%；转染Pgenesil-sur(-)质粒对PC-2细胞Survivin蛋白的表达则无抑制作用(P>0.05)。
图5 不同组Survivin表达情况(免疫组化SP法，DAB显色，×400)
Fig.5 Immunohistochemistry for survivin expression in different groups (SP methods, ×400)
A: Blank control group; B: Negative control group; C: Positive experiment group
2.5 MTT法检测对胰腺癌细胞增殖的抑制作用
MTT法检测结果表明转染Pgenesil-sur(+)质粒后可显著抑制PC-2细胞的增殖，细胞接种后24、48 h的增殖抑制率分别为28.00%和33.38% (P<0.05)。转染Pgenesil-sur(-)质粒对PC-2细胞的增殖无影响(P>0.05)。
2.6 流式细胞术检测PC-2细胞的凋亡
转染后24、48 h，空白对照组、阴性对照组均未检测到细胞凋亡，阳性实验组细胞24、48 h的凋亡率分别为((8.46±1.07)%和(7.53±0.93)%。统计结果表明转染Pgenesil-sur(+)质粒后PC-2细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)，但阳性实验组细胞24、48 h的细胞凋亡率差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
胰腺癌是预后最差的恶性肿瘤之一，手术或化疗后的5年生存率仅为1%~2%。胰腺癌细胞对凋亡的抵抗导致胰腺癌对大多数的抗肿瘤治疗如放疗、化疗、免疫治疗不敏感，这是胰腺癌预后极差的重要原因之一[2]。近年来的研究证实Survivin与恶性肿瘤的关系密切，Survivin在大多数肿瘤组织中存在着高表达，且与肿瘤的发生、发展，与血管形成，与肿瘤的化疗敏感性、放射敏感性以及复发、预后等密切相关， 阻断Survivin基因的表达，可以诱导肿瘤细胞的凋亡，提高肿瘤细胞对化疗药物和放疗的敏感性，抑制肿瘤血管形成[3-4]。对Survivin与胰腺癌关系的研究表明，Survivin在胰腺癌中也存在着过表达，并通过抑制细胞凋亡参与胰腺癌的发生、发展；Survivin与胰腺癌放疗、化疗敏感性相关，是胰腺癌预后的指标[5~8]。这些研究提示Survivin在胰腺癌的基因治疗中具有潜在的重要价值。
目前认为Survivin抑制细胞凋亡的机制可能为：(1)直接或间接抑制caspases(caspase-3、caspase-7、caspase-6、caspase-8、caspase-9、caspase-10)的活性；(2)与cdk4/P21复合物相互作用，释放出P21，P21再与caspase-3结合；(3)与Smac/DIABLO(Second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP binding protein with low Pi)结合并将其隔离，防止Smac/DIABLO与其他的凋亡抑制蛋白结合。对Survivin在细胞分裂过程中定位的研究表明，Survivin与INCENP(inner centromere protein)、Aurora-B等共同在调节细胞周期、细胞分裂的过程中扮演了重要角色。阻断Survivin的表达，可以破坏微管的形成，导致多倍体的形成和细胞分裂失败[9]。
RNAi是自然界生物体的一种遗传现象，是一种由双链RNA介导的序列特异性的转录后的基因沉默过程。当外源性的双链RNA进入细胞后，被RNAseIII蛋白家族成员之一的Dicer酶所识别并被切割为21~23个核苷酸的短的双链RNA，即小干扰RNA (siRNA)。siRNA与RNA介导的沉默复合体结合后，识别并降解同源的mRNA，从而特异性地抑制目的基因的表达[10]，具有高效、特异、低毒的特点。自发现以来，siRNA已广泛应用于基因功能、肿瘤和病毒性疾病治疗等的研究。本实验中，我们参考Kappler 等[1]的序列，设计构建了靶向Survivin的siRNA质粒表达载体，其转录产物可在体内形成由1个茎环所分离的具有反向重复序列的发卡样RNA，此RNA随后被加工成siRNA而降解靶基因mRNA，达到阻断靶基因表达的目的。本实验中所构建的siRNA质粒表达载体中含有增强的绿色荧光蛋白，可以方便地观察到转染的效果。进行RNAi研究时，目的基因靶序列的选择至关重要，针对不同的靶序列干扰的效果可能相差甚远[11]。本实验所参考Kappler等[1]的序列已证实对多种肿瘤细胞有效[12]。我们的实验亦证实该序列对胰腺癌、乳腺癌有效(另文发表)，提示该序列可能具有通用性，可以作为研究靶向Survivin的RNAi时的优先考虑的序列。我们采用免疫组化技术来检测Survivin在蛋白质水平的表达变化有一个显著的优点，即在同一张细胞爬片上本身就存在着自身对照(转染成功的细胞和未转染的的细胞)，可以直观地看到RNAi的效果。
RT-PCR和免疫组化检测结果表明，本实验中所构建的靶向Survivin的siRNA质粒表达载体具有高度特异性，可以有效地抑制PC-2细胞Survivin的表达。抑制PC-2细胞Survivin基因的表达可以显著抑制PC-2细胞的增殖并诱发一定程度的自发调亡，提示靶向Survivin的siRNA在胰腺癌的治疗中具有一定的价值，为今后进一步研究提供了必要的实验基础。
参考文献：
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Liu JW, Li KZ, Dou KF, et al. Survivin antisense oligonucleotide induces apoptosis and sensitizes pancreatic cancer cells to Gemcitabine[J]. Chin J Gen Surg, 2004, 19(7): 401-3.
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Lu X, Zheng QC, Xiong J, et al. Inhibitory effect of siRNA on Survivin expression in HepG2 cells[J]. J Huazhong Univ Sci Tech (Health Sci), 2004, 33(6): 696-9.
基金项目：陕西省科技攻关项目[2004K13-G11(1)]
Supported by the Key Science and Technology Research Project of Shaanxi Province [2004K13-G11(1)]
作者简介：管海涛(1971-)，男，在读博士研究生，主治医师
(西安交通大学第二医院1肿瘤外科，3普通外科，陕西 西安710004；2西安交通大学口腔医院医学研究中心，陕西 西安710004), 百拇医药(管海涛1，薛兴欢1，王西京1，李 昂2 ，秦兆寅3)