重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)促进大鼠烫伤创面愈合的实验研究
摘 要 目的 通过结缔组织生长因子(CTGF)的局部应用，观察其对烫伤创面愈合的促进作用。方法 大鼠随机分为用药组和对照组，复制深Ⅱ度烫伤模型，每组为自体对照，用药物和基质，烫伤次日起，开始给药并对创面拍照，观察创面结痂时、创面完全愈合时分别取愈合组织做光镜、电镜、细胞周期检测。结果 ①给药第15天中剂量(30 ng)、高剂量(100 ng)组受试侧创面相对愈合面积与同组对照侧差异显著(P<0.05)；②创面完全脱痂时取组织，光学显微镜观察并评分，10 ng组受试侧与对照侧相比差异显著(P<0.05)；③电子显微镜观察,各剂量组受试侧纤维排列明显较对照侧更近似于正常皮肤；④流式细胞仪检测结果显示，中剂量组、高剂量组受试侧细胞G1期较对照侧短，并有差异显著性(P<0.05)。结论 局部应用合适剂量CTGF可促进深Ⅱ度烫伤创面愈合，缩短创面愈合时间。
关键词 结缔组织生长因子；烫伤；创面
The effect of recombinant human connective tissue growth factor improving burns healing in rat
XIE Zhengfu，Yu Shuqing
(1. Guangdong Provincial Center for Drug Evaluation and Certification，Guangzhou 510080, China; 2. Section of Pharmacology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
Abstract Objective To observe the effect of recombinant human connective tissue growth factor on burn healing in rat. Methods Rats were randomly divided into 5 groups, which were groups treated with three different concentrations of rhCTGF, control group and bFGF group. Second degree burn were made on the back of each rat. Scoring of burn area and histology measuring is used to assess the healing effects. Results All the burn areas were reduced within the time duration, with dose rhCTGF had the best effect. Conclusion It suggested that rhCTGF could accelerate wound healing and the moderate dose rhCTGF (30 ng)has the better effect.
Key words recombinant connective tissue growth factor; burn; healing
结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是近年来新发现的即刻早期生物活性因子，即刻早期基因家族包括多个物种的一组在基因序列上具有较高同源性的调节蛋白[1]。其中CTGF分子量约38 kDa，是由血小板源生长因子(PDGF)诱导人类脐静脉内皮细胞而产生，其基因的产物是一种间充质细胞的生长因子，在细胞分化及细胞增殖周期中起到重要的调节作用，并具有促进成纤维细胞，血管内皮细胞等生长繁殖作用，因而被认为是该家族中最具潜在应用意义的因子[1]。国外已有应用CTGF于临床诊断肺肾纤维细胞增生紊乱，心脏冠状动脉栓塞。CTGF及其相关因子的基因及生物活性已有国外资料报道[2]，但其对创伤修复的影响较少见报道。CTGF生物学活性类似于PDGF，可以启动一系列介导组织修复和再生的生物学过程，如由各种结缔组织细胞导致的胞外基质再生，创伤处炎细胞的趋化，纤维对创伤的填充等，是创伤组织进行修复再生过程的主要调节因子。我们通过局部应用rhCTGF于深Ⅱ度烫伤大鼠皮肤，观察到其对创面愈合的促进作用，并初步确定了有效剂量。
1 材 料
1.1 受试药及阳性药
1.1.1 rhCTGF
中国医学科学院昆明医学生物学研究所提供(3 μg/mL·支-1)，冰冻保存，每日给药前解冻，生理盐水稀释至10，30，100 ng/0.1 mL。
1.1.2 阳性药
重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)，珠海东大生物工程有限公司提供，4 000 U/瓶。
1.2 实验动物
健康SD大鼠(东南大学动物中心提供)。实验前1周领取，雌雄各半，体重180~220 g，随机分组，每组8只，单笼喂养，自由饮水，饮食。
1.3 主要试剂
脱毛剂：ρ=10% Na2S,新鲜蒸馏水当天配制;麻醉剂：ρ=0.6%戊巴比妥钠，新鲜蒸馏水当天配制;3 mg/0.5 mL·100 g-1固体石蜡;饿酸(Johanson Matthey,Materials Technology，U.K.0.5 mg);胰蛋白酶(华美生物工程公司);胶原酶1型(Worthington biochemical corporation);PBS (pH 7.0,pH 7.3,临用前新鲜蒸馏水配制)，Hanks液(临用前新鲜蒸馏水配制)。
1.4 实验仪器
数码相机(FUJIFILM 日本富士公司)，光学显微镜，电子显微镜(ISISX40 日本)，流式细胞仪 (FACS Calibur 美国BD公司)，烫伤模具(自制￠2.5 cm玻璃管，L 6 cm，端口磨平整，光滑，距一端口1 cm处有黑色划线)。
2 方 法
2.1 实验组别及给药方法
2.1.1 模型制备[3]
大鼠背部剪毛，约8 cm×8 cm，戊巴比妥钠麻醉，固定四肢，脱毛剂脱毛，暴露皮肤，生理盐水清洗3次，干棉球擦干。固体石蜡置烧杯中熔化，调节液体温度至150 ℃，倾入放置于大鼠背部的烫伤模具中至1 cm划线处，待凝，约3 min后取下模具及已凝石蜡，则形成每只动物左右2个2.5 cm创面。肉眼观察，组织学检查判定为深Ⅱ度烫伤。
2.1.2 本实验设模型对照组,受试(10、30、100 ng组)阳性组。各组动物左右两侧皮肤分别造模，造模后次日起开始给药，0.1 mL/只，阳性组给阳性药250 U/03 mL·kg-1，另一侧给等量生理盐水，随机一侧敷药后无菌纱布包扎，相同处理，每日1次，共14 d。
2.2 观察指标及方法
2.2.1 创面面积及愈合时间
每日于给药前数码相机拍照，照片输入计算机，专业图像处理软件Motic pro 5.0(厦门麦克奥迪实业集团公司)分析并计算创伤面积，以创面愈合率对时间回归，定义60%愈合面积，计算各组所用时间。
2.2.2 光学显微镜
创面恢复至痂皮全部脱落时取创面皮肤1 cm×1 cm,φ=10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片HE染色，光学显微镜观察。
2.2.3 电子显微镜
创面结痂、开始愈合时随机取创伤组织0.5 cm×0.5 cm，ρ=4%戊二醛固定过夜，0.1 mol/L PBS(pH7.3)清洗，锇酸固定(PBS配制)2 h，PBS清洗，梯度乙醇脱水(φ=30%、50%、70%、90%，无水乙醇)，无水丙酮脱水，临界点干燥，固定上台，镀膜，作扫描电镜观察。
2.2.4 细胞周期检测
创面脱痂时取恢复皮肤0.5 cm×0.5 cm，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶(按照每克湿组织20 mL加入)37 ℃水浴消化8~10 min，10倍Hanks液终止消化，100目筛过滤，去除大块未消化的组织，加入ρ=0.01%胶原酶(按原组织湿重每克加10 mL)37 ℃水浴消化10 min，200目筛过滤，滤液1 500 r/min离心10 min，倾去上清；加入PBS振荡1 500 r/min离心10 min；弃上清，加入ρ=0.1%TritonX100摇匀后静置10 min，离心5 min，弃上清；加入ρ=0.01%RNA酶消化10 min后离心5 min，弃上清液后加入ρ=0.005% PI染色15 min，300目丝网过滤，流式细胞仪进样，Cell quest软件收集细胞，ModFit LT软件分析细胞G1期。
2.3 数据处理及统计方法
创面愈合率=(S1-Sn)/S1×100%，S1：第1天创面面积；Sn：第n天创面面积，记量数据以±s表示，组内或组间Student t检验。
3 结 果
3.1 模型制备
重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)促进大鼠烫伤创面愈合的实验研究模型组造模后第1天见创面整体发白，组织略有淤血，造模后3~5 d各组创面开始结痂，形成完整创面，第7~9天开始有痂皮脱落。光镜下表皮有凝固性坏死，坏死层与存活皮下组织间有白细胞浸润带，愈合期间痂下有组织充血，水肿，小血管内血栓形成，血管周围有出血，根据烧伤“三度四分法”可判定为深Ⅱ度，提示造模成功。
3.2 rhCTGF对创面面积的影响
造模同一时相(d)面积见表1。第6天30 ng组受试侧与对照侧相比差异显著。不同时相各创面相对愈合面积见表2。表1 rhCTGF对大鼠皮肤创面面积愈合率的影响(略)表2 rhCTGF对大鼠Ⅱ度烫伤创面面积愈合率的影响(略)
30 ng组不同时相创面相对愈合面积受试侧与对照侧有显著性差异，100 ng组受试侧与对照侧差异非常显著。分析创面相对愈合面积与时间关系见表3。
以创面愈合60%所用时间，判别愈合速度由快至慢为rhCTGF 100 ng>rhCTGF 30 ng>rhCTGF 10 ng。
3.3 rhCTGF对创面愈合的组织学影响
结果见表4。镜下观察根据表皮坏死脱落程度，嗜中性白细胞渗出的多少由轻到重评分，根据表皮再生程度创伤处肉牙增生，间质疏松水肿，炎细胞浸润程度每块组织分别评分，结果显未低剂量组受试侧与对照侧差异显著。表3 rhCTGF对创面面积愈合60%时间的影响(略)
3.4 rhCTGF对创面细胞纤维的影响
结果见表5。镜下可见各剂量组成纤维细胞，胶原纤维，其中受试侧明显较对照侧整齐，更近似于正常皮肤。 表4 rhCTGF对创面愈合的组织学影响(略)表5 电镜观察rhCTGF对创面细胞及纤维的影响(略)
3.5 细胞周期
结果见表6。中剂量组与高剂量组受试侧G1期较对照侧短，差异有显著性。表6 rhCTGF对创面细胞周期的影响(略)
4 讨 论
创伤修复是一个复杂的动力学过程，其全过程分为炎症期、增殖修复期、瘢痕形成期。炎症期成纤维细胞、表皮细胞和血管内皮细胞向创伤部位移动。增殖和修复期，细胞增殖，细胞间质蛋白合成，新的血管形成。瘢痕形成期，细胞增殖和血管化停止。在创伤修复过程中，机体组织会分泌一些生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)等，当然也包括结缔组织生长因子。创伤部位细胞的多样性和合成活性由各种生长因子调节，基可促进细胞间质合成，促进血管生长等。
CTGF基因的产物是一种间充质细胞的生长因子，间充质细胞可分化为成纤维细胞，骨原细胞，网状细胞和脂肪细胞，因此rhCTGF作用较bFGF早，具有促进成纤维细胞、血管内皮细胞生长繁殖的作用，在细胞分化及增殖周期中起到重要调节作用，因而在创伤修复的炎症期，增殖和修复期有较强作用。
由于人的CTGF和鼠的CTGF有95%的同源性[1]，故本实验选择受试动物为大鼠。
本实验模型为深Ⅱ度。由于CTGF主要作用于成纤维细胞、血管内皮细胞，故对真皮愈合有较好的作用，因此实验选用了深Ⅱ度模型。经多次试验得出：固体石蜡熔化加温至150 ℃，可致大鼠深Ⅱ度烫伤。
细胞周期检测得出rhCTGF 30 ng、100 ng组受试侧的G1期较对照侧短，并有显著性差异，此结果表明rhCTGF可缩短细胞G1期，即受试侧细胞增殖分裂较对照侧旺盛，因而前者愈合较后者快。
扫描电镜中我们观察到各剂量组受试侧与对照侧的差异主要表现在纤维的排列上，受试侧纤维排列较为紧密整齐，成束状，更类似于正常皮肤，而对照侧纤维的排列较为零乱，我们在判断药效的基础上推测受试侧是否降低了形成瘢痕的几率。
然而光镜的结果显示rhCTGF 10 ng组效果较30、100 ng组明显，与其他指示结果有差异，有待进一步研究。
根据创面愈合面积时间分析，创面愈合率与剂量有较好的相关性，实验中3个剂量均有效促进了创面的愈合，各项指标综合可见rhCTGF 30、100 ng组效果较10 ng组好。
参考文献
[1]李琦涵,姜莉，昝瑞光，等.一个新的即刻早期基因家族与创伤修复过程[J].国外医学·生理病理科学与临床分册,1999，19(6)：535.
[2]Johanna Dammeier，HansDietmar Beer.Dexamethasone is a novel potent Inducer of connective tissue growth factor expression[J].The Journal of Biological Chemistry,1998,273(29):18 185.
[3]孙同柱，付小兵,顾小曼，等.重组人表皮生长因子促进兔烫伤创面愈合的实验研究[J].实验动物科学与管理,2000 ,17(4):12.
1.广东省药品审评认证中心 广东 广州 510080；
2.中国药科大学 药理教研室 江苏 南京 210009, http://www.100md.com(谢正福 余书勤)
关键词 结缔组织生长因子；烫伤；创面
The effect of recombinant human connective tissue growth factor improving burns healing in rat
XIE Zhengfu，Yu Shuqing
(1. Guangdong Provincial Center for Drug Evaluation and Certification，Guangzhou 510080, China; 2. Section of Pharmacology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
Abstract Objective To observe the effect of recombinant human connective tissue growth factor on burn healing in rat. Methods Rats were randomly divided into 5 groups, which were groups treated with three different concentrations of rhCTGF, control group and bFGF group. Second degree burn were made on the back of each rat. Scoring of burn area and histology measuring is used to assess the healing effects. Results All the burn areas were reduced within the time duration, with dose rhCTGF had the best effect. Conclusion It suggested that rhCTGF could accelerate wound healing and the moderate dose rhCTGF (30 ng)has the better effect.
Key words recombinant connective tissue growth factor; burn; healing
结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是近年来新发现的即刻早期生物活性因子，即刻早期基因家族包括多个物种的一组在基因序列上具有较高同源性的调节蛋白[1]。其中CTGF分子量约38 kDa，是由血小板源生长因子(PDGF)诱导人类脐静脉内皮细胞而产生，其基因的产物是一种间充质细胞的生长因子，在细胞分化及细胞增殖周期中起到重要的调节作用，并具有促进成纤维细胞，血管内皮细胞等生长繁殖作用，因而被认为是该家族中最具潜在应用意义的因子[1]。国外已有应用CTGF于临床诊断肺肾纤维细胞增生紊乱，心脏冠状动脉栓塞。CTGF及其相关因子的基因及生物活性已有国外资料报道[2]，但其对创伤修复的影响较少见报道。CTGF生物学活性类似于PDGF，可以启动一系列介导组织修复和再生的生物学过程，如由各种结缔组织细胞导致的胞外基质再生，创伤处炎细胞的趋化，纤维对创伤的填充等，是创伤组织进行修复再生过程的主要调节因子。我们通过局部应用rhCTGF于深Ⅱ度烫伤大鼠皮肤，观察到其对创面愈合的促进作用，并初步确定了有效剂量。
1 材 料
1.1 受试药及阳性药
1.1.1 rhCTGF
中国医学科学院昆明医学生物学研究所提供(3 μg/mL·支-1)，冰冻保存，每日给药前解冻，生理盐水稀释至10，30，100 ng/0.1 mL。
1.1.2 阳性药
重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)，珠海东大生物工程有限公司提供，4 000 U/瓶。
1.2 实验动物
健康SD大鼠(东南大学动物中心提供)。实验前1周领取，雌雄各半，体重180~220 g，随机分组，每组8只，单笼喂养，自由饮水，饮食。
1.3 主要试剂
脱毛剂：ρ=10% Na2S,新鲜蒸馏水当天配制;麻醉剂：ρ=0.6%戊巴比妥钠，新鲜蒸馏水当天配制;3 mg/0.5 mL·100 g-1固体石蜡;饿酸(Johanson Matthey,Materials Technology，U.K.0.5 mg);胰蛋白酶(华美生物工程公司);胶原酶1型(Worthington biochemical corporation);PBS (pH 7.0,pH 7.3,临用前新鲜蒸馏水配制)，Hanks液(临用前新鲜蒸馏水配制)。
1.4 实验仪器
数码相机(FUJIFILM 日本富士公司)，光学显微镜，电子显微镜(ISISX40 日本)，流式细胞仪 (FACS Calibur 美国BD公司)，烫伤模具(自制￠2.5 cm玻璃管，L 6 cm，端口磨平整，光滑，距一端口1 cm处有黑色划线)。
2 方 法
2.1 实验组别及给药方法
2.1.1 模型制备[3]
大鼠背部剪毛，约8 cm×8 cm，戊巴比妥钠麻醉，固定四肢，脱毛剂脱毛，暴露皮肤，生理盐水清洗3次，干棉球擦干。固体石蜡置烧杯中熔化，调节液体温度至150 ℃，倾入放置于大鼠背部的烫伤模具中至1 cm划线处，待凝，约3 min后取下模具及已凝石蜡，则形成每只动物左右2个2.5 cm创面。肉眼观察，组织学检查判定为深Ⅱ度烫伤。
2.1.2 本实验设模型对照组,受试(10、30、100 ng组)阳性组。各组动物左右两侧皮肤分别造模，造模后次日起开始给药，0.1 mL/只，阳性组给阳性药250 U/03 mL·kg-1，另一侧给等量生理盐水，随机一侧敷药后无菌纱布包扎，相同处理，每日1次，共14 d。
2.2 观察指标及方法
2.2.1 创面面积及愈合时间
每日于给药前数码相机拍照，照片输入计算机，专业图像处理软件Motic pro 5.0(厦门麦克奥迪实业集团公司)分析并计算创伤面积，以创面愈合率对时间回归，定义60%愈合面积，计算各组所用时间。
2.2.2 光学显微镜
创面恢复至痂皮全部脱落时取创面皮肤1 cm×1 cm,φ=10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片HE染色，光学显微镜观察。
2.2.3 电子显微镜
创面结痂、开始愈合时随机取创伤组织0.5 cm×0.5 cm，ρ=4%戊二醛固定过夜，0.1 mol/L PBS(pH7.3)清洗，锇酸固定(PBS配制)2 h，PBS清洗，梯度乙醇脱水(φ=30%、50%、70%、90%，无水乙醇)，无水丙酮脱水，临界点干燥，固定上台，镀膜，作扫描电镜观察。
2.2.4 细胞周期检测
创面脱痂时取恢复皮肤0.5 cm×0.5 cm，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶(按照每克湿组织20 mL加入)37 ℃水浴消化8~10 min，10倍Hanks液终止消化，100目筛过滤，去除大块未消化的组织，加入ρ=0.01%胶原酶(按原组织湿重每克加10 mL)37 ℃水浴消化10 min，200目筛过滤，滤液1 500 r/min离心10 min，倾去上清；加入PBS振荡1 500 r/min离心10 min；弃上清，加入ρ=0.1%TritonX100摇匀后静置10 min，离心5 min，弃上清；加入ρ=0.01%RNA酶消化10 min后离心5 min，弃上清液后加入ρ=0.005% PI染色15 min，300目丝网过滤，流式细胞仪进样，Cell quest软件收集细胞，ModFit LT软件分析细胞G1期。
2.3 数据处理及统计方法
创面愈合率=(S1-Sn)/S1×100%，S1：第1天创面面积；Sn：第n天创面面积，记量数据以±s表示，组内或组间Student t检验。
3 结 果
3.1 模型制备
重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)促进大鼠烫伤创面愈合的实验研究模型组造模后第1天见创面整体发白，组织略有淤血，造模后3~5 d各组创面开始结痂，形成完整创面，第7~9天开始有痂皮脱落。光镜下表皮有凝固性坏死，坏死层与存活皮下组织间有白细胞浸润带，愈合期间痂下有组织充血，水肿，小血管内血栓形成，血管周围有出血，根据烧伤“三度四分法”可判定为深Ⅱ度，提示造模成功。
3.2 rhCTGF对创面面积的影响
造模同一时相(d)面积见表1。第6天30 ng组受试侧与对照侧相比差异显著。不同时相各创面相对愈合面积见表2。表1 rhCTGF对大鼠皮肤创面面积愈合率的影响(略)表2 rhCTGF对大鼠Ⅱ度烫伤创面面积愈合率的影响(略)
30 ng组不同时相创面相对愈合面积受试侧与对照侧有显著性差异，100 ng组受试侧与对照侧差异非常显著。分析创面相对愈合面积与时间关系见表3。
以创面愈合60%所用时间，判别愈合速度由快至慢为rhCTGF 100 ng>rhCTGF 30 ng>rhCTGF 10 ng。
3.3 rhCTGF对创面愈合的组织学影响
结果见表4。镜下观察根据表皮坏死脱落程度，嗜中性白细胞渗出的多少由轻到重评分，根据表皮再生程度创伤处肉牙增生，间质疏松水肿，炎细胞浸润程度每块组织分别评分，结果显未低剂量组受试侧与对照侧差异显著。表3 rhCTGF对创面面积愈合60%时间的影响(略)
3.4 rhCTGF对创面细胞纤维的影响
结果见表5。镜下可见各剂量组成纤维细胞，胶原纤维，其中受试侧明显较对照侧整齐，更近似于正常皮肤。 表4 rhCTGF对创面愈合的组织学影响(略)表5 电镜观察rhCTGF对创面细胞及纤维的影响(略)
3.5 细胞周期
结果见表6。中剂量组与高剂量组受试侧G1期较对照侧短，差异有显著性。表6 rhCTGF对创面细胞周期的影响(略)
4 讨 论
创伤修复是一个复杂的动力学过程，其全过程分为炎症期、增殖修复期、瘢痕形成期。炎症期成纤维细胞、表皮细胞和血管内皮细胞向创伤部位移动。增殖和修复期，细胞增殖，细胞间质蛋白合成，新的血管形成。瘢痕形成期，细胞增殖和血管化停止。在创伤修复过程中，机体组织会分泌一些生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)等，当然也包括结缔组织生长因子。创伤部位细胞的多样性和合成活性由各种生长因子调节，基可促进细胞间质合成，促进血管生长等。
CTGF基因的产物是一种间充质细胞的生长因子，间充质细胞可分化为成纤维细胞，骨原细胞，网状细胞和脂肪细胞，因此rhCTGF作用较bFGF早，具有促进成纤维细胞、血管内皮细胞生长繁殖的作用，在细胞分化及增殖周期中起到重要调节作用，因而在创伤修复的炎症期，增殖和修复期有较强作用。
由于人的CTGF和鼠的CTGF有95%的同源性[1]，故本实验选择受试动物为大鼠。
本实验模型为深Ⅱ度。由于CTGF主要作用于成纤维细胞、血管内皮细胞，故对真皮愈合有较好的作用，因此实验选用了深Ⅱ度模型。经多次试验得出：固体石蜡熔化加温至150 ℃，可致大鼠深Ⅱ度烫伤。
细胞周期检测得出rhCTGF 30 ng、100 ng组受试侧的G1期较对照侧短，并有显著性差异，此结果表明rhCTGF可缩短细胞G1期，即受试侧细胞增殖分裂较对照侧旺盛，因而前者愈合较后者快。
扫描电镜中我们观察到各剂量组受试侧与对照侧的差异主要表现在纤维的排列上，受试侧纤维排列较为紧密整齐，成束状，更类似于正常皮肤，而对照侧纤维的排列较为零乱，我们在判断药效的基础上推测受试侧是否降低了形成瘢痕的几率。
然而光镜的结果显示rhCTGF 10 ng组效果较30、100 ng组明显，与其他指示结果有差异，有待进一步研究。
根据创面愈合面积时间分析，创面愈合率与剂量有较好的相关性，实验中3个剂量均有效促进了创面的愈合，各项指标综合可见rhCTGF 30、100 ng组效果较10 ng组好。
参考文献
[1]李琦涵,姜莉，昝瑞光，等.一个新的即刻早期基因家族与创伤修复过程[J].国外医学·生理病理科学与临床分册,1999，19(6)：535.
[2]Johanna Dammeier，HansDietmar Beer.Dexamethasone is a novel potent Inducer of connective tissue growth factor expression[J].The Journal of Biological Chemistry,1998,273(29):18 185.
[3]孙同柱，付小兵,顾小曼，等.重组人表皮生长因子促进兔烫伤创面愈合的实验研究[J].实验动物科学与管理,2000 ,17(4):12.
1.广东省药品审评认证中心 广东 广州 510080；
2.中国药科大学 药理教研室 江苏 南京 210009, http://www.100md.com(谢正福 余书勤)