家兔中盐酸多西环素缓释凝胶牙龈给药与口服给药的比较
摘 要 目的 比较盐酸多西环素注入用缓释凝胶局部牙龈给药与口服给药的优劣。方法 分别给家兔口服市售盐酸多西环素片和牙龈注射盐酸多西环素缓释凝胶作自身对照，用高效液相色谱法分别测定两种给药方式的唾药浓度和血药浓度。结果 牙龈注射给药时唾药浓度远高于口服给药，而后者血药浓度亦高于前者。结论 盐酸多西环素缓释凝胶治疗牙周炎的效果优于口服片剂。
关键词 PLGA；盐酸多西环素；缓释凝胶；给药途径
Efficacy of two administration routes of doxycycline hyclate in rabbits
ZHANG Shu, TAN Zaiyou, CHEN jimin
(1.Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou 510240,China; 2.Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110015, China)
Abstract Objective To compare the absorption efficacy of doxycycline hyclate between gingival injection of gel delivery system and oral administration of the tablets. Methods Doxycycline hyclate concentrations in rabbit plasma and saliva were measured by HPLC after injection and oral administration. Results The concentration of doxycycline hyclate in saliva after gingival injection was much higher than that after orally administration of doxycycline hyclate tablets. On the contrary, the plasma concentration of doxycycline hyclate after gingival injection of doxycycline hyclate was much lower than that after oral administration of doxycycline hyclate tablets. Conclusions Gel delivery system of doxycycline hyclate might be more suitable for patients with periodontitis than tablets and other oral preparations.
Key words doxycycline hyclate；controlled release；administration routes
盐酸多西环素(doxycycline hyclate，盐酸强力霉素，盐酸脱氧土霉素)为四环素类抗生素，能有效控制牙周袋的龈下菌斑，抑制牙周病致病菌。目前应用的制剂有片剂，胶囊和粉针，但口服可引起胃肠道反应[1]。我们应用乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制备了可生物降解盐酸多西环素缓释注射凝胶[2]，该制剂是治疗慢性成人牙周炎的局部用药制剂，应用时通过注射器将凝胶注射到患者的牙周袋内，使含药凝胶在牙周袋内凝结固化成固体骨架，在病灶部位释放药物。预期7 d内将在该部位保持较高的药物浓度，理论上讲比口服盐酸多西环素片的效果好。为验证这一结论，我们利用家兔为模型进行自身对照，采用两种给药方式：将盐酸多西环素缓释凝胶注射到家兔的牙龈中模拟牙周袋局部给药；给家兔口服灌胃盐酸多西环素片制成的混悬液，测定两种给药方式下药物在唾液及血浆中的浓度。并将二者进行比较。
1 仪器与试剂
岛津LC-10AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)，东西电子A4800色谱数据工作站(北京东西电子)，LunaC18柱(pH适用范围1.5-10.5，φ5 μ,ID4.6×250 mm，美国菲罗门公司)；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。
盐酸多西环素缓释注射凝胶(自制，批号：20000901)。多西环素对照品等(中国药品生物制品检定所)，盐酸多西环素片(扬州制药厂，0.1 g/100,000单位，批号：20000101)，家兔(体重1.25~2.5 kg，雌雄各半，广东省石马实验动物场)
2 方法与结果
2.1 色谱条件[3]
采用C18化学键合硅胶柱，流动相为ψ(水∶乙腈∶φ=70%高氯酸)=699∶298.5∶25，用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH为2.5。精密称取四环素对照品及多西环素对照品适量，加0.001 mol/L盐酸溶液溶解制成每1 mL中分别约含0.08 mg的混合溶液，进样20 μL测试。结果理论塔板数按多西环素峰计算为3 460，选用四环素为内标物，多西环素峰与四环素峰的分离度为 7.31，符合药典要求。
经200~800 nm波长紫外扫描，盐酸多西环素的最大吸收波长分别是272 nm和344 nm，四环素则在276 nm和352 nm处有最大吸收，由于276 nm处血浆、唾液等有干扰，因此选定350 nm为紫外检测波长。
2.2 空白试验
取空白唾液、空白血浆按样品处理同法测定记录色谱图。结果空白唾液、空白血浆在四环素及多西环素的保留时间处没有出峰，不干扰测定,见图1a、图2。
2.3 唾液和血浆中盐酸多西环素标准曲线的制备
分别精密称取多西环素对照品适量置50 mL棕色量瓶中, 分别用含唾液和空白兔血浆的0.001 mol/L盐酸溶液配制浓度为0、0.504、1.008、2.016、5.04、10.08、15.12及25.2 μg/mL(唾液)和0、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5及10 μg/mL(血浆)的系列溶液。另同法制备5 μg/mL的四环素内标溶液。依次吸取多西环素系列溶液转到10 mL离心管中，加入50 μL四环素内标溶液，血浆加6%维生素C水溶液50 μL，1 mL磷酸-亚硫酸盐缓冲液(Ph＝6)，6 mL乙酸乙酯，漩涡混悬2 min，2500 r/min离心10 min。5 mL有机层转至加有0.2%维生素C甲醇溶液100 μL的 5 mL离心管，室温下氮气流吹干，残渣用50 μL流动相重新溶解，加入0.65 mL正己烷，漩涡振荡1 min，2 500 r/min离心5 min。吸去正己烷层，水层依次进样20 μL，记录色谱图(见图2b)。唾液则直接漩涡振荡，离心进样20 μL，记录色谱图(见图1b)。以四环素为内标，计算多西环素与四环素的峰面积比，以峰面积比对浓度进行一元线性回归方程，得血浆和唾液中药物标准曲线回归方程分别为fs/fr=0.97 596ρ-0.10598，r=0.9945和fs/fr=0.25722ρ-0.076626， r=0.9977，分别在0-10 μg/mL和0-25.2 μg/mL范围内线性良好。
2.4 精密度试验(日内、日间)
精密称取多西环素对照品适量，分别加含有唾液和空白血浆的0001 mol/L盐酸溶液溶解制成每1 mL中分别约含0.504 μg、5.04 μg、15.12 μg(唾液)和0.5 μg、2 μg、10 μg(血浆)的对照品溶液；同2.3处理，进样20 μL，连续测定5次考察日内精密度，连续测定3天考察日间精密度，记录色谱图，计算多西环素与四环素的峰面积比，峰面积比的RSD%分别为唾液：284%~14.86%(日内)，1.50%~10.73%(日间)；血浆：2.39%~5.50%(日内)和261%~628%(日间)，其精密度良好。
家兔中盐酸多西环素缓释凝胶牙龈给药与口服给药的比较2.5 回收率试验 取精密度试验样品，每个浓度测定3份，进样20 μL，记录色谱图，计算回收率。唾液及血浆中多西环素的平均回收率分别为98.30%和98.50%；RSD分别为2.75%和2.37%。本方法准确可靠。
2.6 最低检测限
分别配制1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的含唾液和血浆标准溶液，同2.3处理，唾液与血浆中多西环素的最低检测限均为0.1 μg(S/N＝3)。
2.7 给药及测定
2.7.1 给药
由人口服盐酸多西环素的给药剂量100 mg/75 kg按体表面积换算出1.5 kg家兔口服给药剂量(系数为0.07)[4]为9.50 mg/kg。将盐酸多西环素片研成药粉加水制成混悬液给家兔灌胃。另用注射器将凝胶注射到家兔的牙龈中，注入量为0.1~0.2 mL，记录凝胶重量。
2.7.2 样品采集及测定[5]
将家兔固定，拉出兔舌，夹住预先称重的滤纸条放在兔舌上吸取唾液30 s，取出放入塑料离心管中称重，计算唾液的重量，按比重为1 g/mL折算体积数。将吸有唾液的滤纸条置于塑料离心管中；另自耳缘静脉取血1 mL，置加有一滴10%肝素钠溶液的塑料离心管中，加入0.001 mol/L盐酸溶液1 mL，同2.3处理。根据标准曲线回归方程计算药物释放度。结果见图3和图4。
3 结果与讨论
由图3和图4可见，家兔牙龈注射给药时唾液血药浓度最大为4.5 μg/mL，远高于口服给药(最大为1.7 μg/mL)，而口服给药时血药浓度则高于牙龈注射给药，预示局部牙周袋注射给药时牙周袋中的药物浓度将明显高于口服给药，药物可以浓集于牙周袋中产生抑菌作用。且7 d内唾液中的药物浓度均维持在1 μg/mL以上，预计牙周袋中能维持最小抑菌浓度MIC＝6 μg/mL以上，这有待培养牙周炎动物模型后进一步做药效试验来验证。
此外，图4中家兔口服给药后唾药浓度高于血药浓度，原因可能是由于灌胃时部分药物残留在口腔中，导致唾药浓度较高。
由于文献报道的牙周炎的动物模型不太成熟[6-7]，且模型的培养需要较长的时间，因此，本实验以健康家兔为模型，分别给家兔口服市售盐酸多西环素片和牙龈注射盐酸多西环素缓释凝胶作自身对照，用高效液相色谱法分别测定两种给药方式的唾药浓度和血药浓度，结果表明，盐酸多西环素注入用缓释凝胶的缓释时间可达7 d。药物释放完全后聚合物也在体内被降解完全，无需再取出载体，既高效又方便，是新型高效的牙科药物。由本实验结果可以预测盐酸多西环素注入用缓释凝胶治疗牙周炎，尤其是成人慢性牙周炎的效果优于口服片剂。
参考文献
[1]陈新谦，金有豫主编.新编药物学[M].第十四版.北京：人民卫生出版社，1997，7：75.
[2]张蜀，谭载友，陈济民,等. 盐酸多西环素缓释凝胶的制备.中国医药工业杂志[J].2004，35(2):84.
[3]Santos MDF ,Vermeersch H,Remon JP, etc.Validation of a highperformance liquid Chromatogrgraphic method for the determination of doxycycline in turkey plasa. J Chromatogr. B[J].1996, 682:301.
[4]徐叔云主编.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，1994675.
[5]李红英，李成章，魏国贤，等.高效液相色谱法对牙周袋内四环素药物浓度的测定[J].湖北医科大学学报,1996，18(3)：285.
[6]孟焕新，谢昊，陈智滨,等.小型猪实验性牙周炎的观察.中华口腔医学杂志[J].1996，31(6):333.
[7]王晓敏，于世凤.牙周炎动物模型的建立及技术关键[J].牙体牙髓牙周病学杂志,1999，9(1)：89.
1.广东药学院 药研所 广东 广州 510240；
2.沈阳药科大学 辽宁 沈阳 110015, http://www.100md.com(张蜀 谭载友 陈济民)
关键词 PLGA；盐酸多西环素；缓释凝胶；给药途径
Efficacy of two administration routes of doxycycline hyclate in rabbits
ZHANG Shu, TAN Zaiyou, CHEN jimin
(1.Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou 510240,China; 2.Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110015, China)
Abstract Objective To compare the absorption efficacy of doxycycline hyclate between gingival injection of gel delivery system and oral administration of the tablets. Methods Doxycycline hyclate concentrations in rabbit plasma and saliva were measured by HPLC after injection and oral administration. Results The concentration of doxycycline hyclate in saliva after gingival injection was much higher than that after orally administration of doxycycline hyclate tablets. On the contrary, the plasma concentration of doxycycline hyclate after gingival injection of doxycycline hyclate was much lower than that after oral administration of doxycycline hyclate tablets. Conclusions Gel delivery system of doxycycline hyclate might be more suitable for patients with periodontitis than tablets and other oral preparations.
Key words doxycycline hyclate；controlled release；administration routes
盐酸多西环素(doxycycline hyclate，盐酸强力霉素，盐酸脱氧土霉素)为四环素类抗生素，能有效控制牙周袋的龈下菌斑，抑制牙周病致病菌。目前应用的制剂有片剂，胶囊和粉针，但口服可引起胃肠道反应[1]。我们应用乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制备了可生物降解盐酸多西环素缓释注射凝胶[2]，该制剂是治疗慢性成人牙周炎的局部用药制剂，应用时通过注射器将凝胶注射到患者的牙周袋内，使含药凝胶在牙周袋内凝结固化成固体骨架，在病灶部位释放药物。预期7 d内将在该部位保持较高的药物浓度，理论上讲比口服盐酸多西环素片的效果好。为验证这一结论，我们利用家兔为模型进行自身对照，采用两种给药方式：将盐酸多西环素缓释凝胶注射到家兔的牙龈中模拟牙周袋局部给药；给家兔口服灌胃盐酸多西环素片制成的混悬液，测定两种给药方式下药物在唾液及血浆中的浓度。并将二者进行比较。
1 仪器与试剂
岛津LC-10AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)，东西电子A4800色谱数据工作站(北京东西电子)，LunaC18柱(pH适用范围1.5-10.5，φ5 μ,ID4.6×250 mm，美国菲罗门公司)；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。
盐酸多西环素缓释注射凝胶(自制，批号：20000901)。多西环素对照品等(中国药品生物制品检定所)，盐酸多西环素片(扬州制药厂，0.1 g/100,000单位，批号：20000101)，家兔(体重1.25~2.5 kg，雌雄各半，广东省石马实验动物场)
2 方法与结果
2.1 色谱条件[3]
采用C18化学键合硅胶柱，流动相为ψ(水∶乙腈∶φ=70%高氯酸)=699∶298.5∶25，用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH为2.5。精密称取四环素对照品及多西环素对照品适量，加0.001 mol/L盐酸溶液溶解制成每1 mL中分别约含0.08 mg的混合溶液，进样20 μL测试。结果理论塔板数按多西环素峰计算为3 460，选用四环素为内标物，多西环素峰与四环素峰的分离度为 7.31，符合药典要求。
经200~800 nm波长紫外扫描，盐酸多西环素的最大吸收波长分别是272 nm和344 nm，四环素则在276 nm和352 nm处有最大吸收，由于276 nm处血浆、唾液等有干扰，因此选定350 nm为紫外检测波长。
2.2 空白试验
取空白唾液、空白血浆按样品处理同法测定记录色谱图。结果空白唾液、空白血浆在四环素及多西环素的保留时间处没有出峰，不干扰测定,见图1a、图2。
2.3 唾液和血浆中盐酸多西环素标准曲线的制备
分别精密称取多西环素对照品适量置50 mL棕色量瓶中, 分别用含唾液和空白兔血浆的0.001 mol/L盐酸溶液配制浓度为0、0.504、1.008、2.016、5.04、10.08、15.12及25.2 μg/mL(唾液)和0、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5及10 μg/mL(血浆)的系列溶液。另同法制备5 μg/mL的四环素内标溶液。依次吸取多西环素系列溶液转到10 mL离心管中，加入50 μL四环素内标溶液，血浆加6%维生素C水溶液50 μL，1 mL磷酸-亚硫酸盐缓冲液(Ph＝6)，6 mL乙酸乙酯，漩涡混悬2 min，2500 r/min离心10 min。5 mL有机层转至加有0.2%维生素C甲醇溶液100 μL的 5 mL离心管，室温下氮气流吹干，残渣用50 μL流动相重新溶解，加入0.65 mL正己烷，漩涡振荡1 min，2 500 r/min离心5 min。吸去正己烷层，水层依次进样20 μL，记录色谱图(见图2b)。唾液则直接漩涡振荡，离心进样20 μL，记录色谱图(见图1b)。以四环素为内标，计算多西环素与四环素的峰面积比，以峰面积比对浓度进行一元线性回归方程，得血浆和唾液中药物标准曲线回归方程分别为fs/fr=0.97 596ρ-0.10598，r=0.9945和fs/fr=0.25722ρ-0.076626， r=0.9977，分别在0-10 μg/mL和0-25.2 μg/mL范围内线性良好。
2.4 精密度试验(日内、日间)
精密称取多西环素对照品适量，分别加含有唾液和空白血浆的0001 mol/L盐酸溶液溶解制成每1 mL中分别约含0.504 μg、5.04 μg、15.12 μg(唾液)和0.5 μg、2 μg、10 μg(血浆)的对照品溶液；同2.3处理，进样20 μL，连续测定5次考察日内精密度，连续测定3天考察日间精密度，记录色谱图，计算多西环素与四环素的峰面积比，峰面积比的RSD%分别为唾液：284%~14.86%(日内)，1.50%~10.73%(日间)；血浆：2.39%~5.50%(日内)和261%~628%(日间)，其精密度良好。
家兔中盐酸多西环素缓释凝胶牙龈给药与口服给药的比较2.5 回收率试验 取精密度试验样品，每个浓度测定3份，进样20 μL，记录色谱图，计算回收率。唾液及血浆中多西环素的平均回收率分别为98.30%和98.50%；RSD分别为2.75%和2.37%。本方法准确可靠。
2.6 最低检测限
分别配制1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的含唾液和血浆标准溶液，同2.3处理，唾液与血浆中多西环素的最低检测限均为0.1 μg(S/N＝3)。
2.7 给药及测定
2.7.1 给药
由人口服盐酸多西环素的给药剂量100 mg/75 kg按体表面积换算出1.5 kg家兔口服给药剂量(系数为0.07)[4]为9.50 mg/kg。将盐酸多西环素片研成药粉加水制成混悬液给家兔灌胃。另用注射器将凝胶注射到家兔的牙龈中，注入量为0.1~0.2 mL，记录凝胶重量。
2.7.2 样品采集及测定[5]
将家兔固定，拉出兔舌，夹住预先称重的滤纸条放在兔舌上吸取唾液30 s，取出放入塑料离心管中称重，计算唾液的重量，按比重为1 g/mL折算体积数。将吸有唾液的滤纸条置于塑料离心管中；另自耳缘静脉取血1 mL，置加有一滴10%肝素钠溶液的塑料离心管中，加入0.001 mol/L盐酸溶液1 mL，同2.3处理。根据标准曲线回归方程计算药物释放度。结果见图3和图4。
3 结果与讨论
由图3和图4可见，家兔牙龈注射给药时唾液血药浓度最大为4.5 μg/mL，远高于口服给药(最大为1.7 μg/mL)，而口服给药时血药浓度则高于牙龈注射给药，预示局部牙周袋注射给药时牙周袋中的药物浓度将明显高于口服给药，药物可以浓集于牙周袋中产生抑菌作用。且7 d内唾液中的药物浓度均维持在1 μg/mL以上，预计牙周袋中能维持最小抑菌浓度MIC＝6 μg/mL以上，这有待培养牙周炎动物模型后进一步做药效试验来验证。
此外，图4中家兔口服给药后唾药浓度高于血药浓度，原因可能是由于灌胃时部分药物残留在口腔中，导致唾药浓度较高。
由于文献报道的牙周炎的动物模型不太成熟[6-7]，且模型的培养需要较长的时间，因此，本实验以健康家兔为模型，分别给家兔口服市售盐酸多西环素片和牙龈注射盐酸多西环素缓释凝胶作自身对照，用高效液相色谱法分别测定两种给药方式的唾药浓度和血药浓度，结果表明，盐酸多西环素注入用缓释凝胶的缓释时间可达7 d。药物释放完全后聚合物也在体内被降解完全，无需再取出载体，既高效又方便，是新型高效的牙科药物。由本实验结果可以预测盐酸多西环素注入用缓释凝胶治疗牙周炎，尤其是成人慢性牙周炎的效果优于口服片剂。
参考文献
[1]陈新谦，金有豫主编.新编药物学[M].第十四版.北京：人民卫生出版社，1997，7：75.
[2]张蜀，谭载友，陈济民,等. 盐酸多西环素缓释凝胶的制备.中国医药工业杂志[J].2004，35(2):84.
[3]Santos MDF ,Vermeersch H,Remon JP, etc.Validation of a highperformance liquid Chromatogrgraphic method for the determination of doxycycline in turkey plasa. J Chromatogr. B[J].1996, 682:301.
[4]徐叔云主编.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，1994675.
[5]李红英，李成章，魏国贤，等.高效液相色谱法对牙周袋内四环素药物浓度的测定[J].湖北医科大学学报,1996，18(3)：285.
[6]孟焕新，谢昊，陈智滨,等.小型猪实验性牙周炎的观察.中华口腔医学杂志[J].1996，31(6):333.
[7]王晓敏，于世凤.牙周炎动物模型的建立及技术关键[J].牙体牙髓牙周病学杂志,1999，9(1)：89.
1.广东药学院 药研所 广东 广州 510240；
2.沈阳药科大学 辽宁 沈阳 110015, http://www.100md.com(张蜀 谭载友 陈济民)