“手十二井穴”刺络放血对大鼠局灶性脑缺血后SOD活性和MDA含量的影响
摘要：目的 观察“手十二井穴”刺络放血对大鼠局灶性脑缺血后超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影响。方法 大鼠随机分为假手术组、缺血组、“手十二井穴”刺络放血组。采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，缺血30min、1h、2h、4h后处死动物取脑，分别测定SOD活性和MDA含量。结果 与缺血组相比，“手十二井穴”刺络放血组MDA含量明显降低，SOD活性明显升高(P<0.01)。结论 “手十二井穴”刺络放血对实验性脑缺血损伤有保护作用，其机制可能与其提高SOD活性、清除自由基、减轻脂质过氧化反应有关。
关键词：手十二井穴；刺络放血；局灶性脑缺血；超氧化物歧化酶；丙二醛
The Effects of Bloodletting Puncture in Twelvewell
Points of the Hand on Content of MDA and Activity of
SOD after Focal Cerebral Ischemia in Rats
HUANG Bilan, YU Liangzhu, LIU Shouxian,et al
(Department of Physiology, Xianning College,Xianning Hubei 437100,China)
ABSTRACT:Objective To observe the effects of bloodletting puncture in‘twelvewell points of the hand’on content of MDA and activity of SOD after focal cerebral ischemia in rats. Methods The rats were randomly divided into the sham operated group, cerebral ischemia group, bloodletting puncture in ‘twelvewell points of the hand’group. The animal models were established by middle cerebral artery occlusion (MCAO)in rats. Brain ischemia was caused by MCAO for 30min,1h,2h and 4h respectively in rats. Brain damage was measured by content of MDA and activity of SOD.Results In bloodletting puncture in ‘twelvewell point of the hand’group the content of MDA were obviously decreased whereas activity of SOD were obviously increased in comparison with those of the cerebral ischemia group(P<0.01). Conclusion Bloodletting puncture in ‘twelvewell point of the hand’has good protective effect on rat with acute brain injury by focal cerebral ischemia. The mechanism may be associated with increase of SOD activity, clearance peroxyl radical and inhibition lipid peroxidation.
KEY WORDS：Twelvewell point of the hand; Bloodletting puncture; Focal cerebral ischemia; SOD; MDA
现代研究发现[1]，自由基及其介导的脂质过氧化连锁反应是脑缺血损伤的主要原因。有效的阻止氧自由基的产生或增强其清除是脑缺血治疗的重要措施之一。“手十二井穴”刺络疗法是治疗脑缺血的一种有效急救方法[2]。有资料证明：“手十二井穴”刺络放血可使急性实验性脑缺血家兔脑血流图波幅升高，有明显扩张脑血管作用[3]，对大鼠脑缺血引起的钙调素含量升高有一定的抑制作用[4]。本实验通过制备局灶性脑缺血模型，观察“手十二井穴”刺络放血对大鼠缺血区脑组织SOD活性和MDA含量的影响，以探讨“手十二井穴”刺络放血抗脑缺血的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
健康Wistar大鼠，雌雄不拘，体重250~300g(由本院实验动物中心提供)。动物随机分为三组：假手术组、缺血组、“手十二井穴”刺络放血组(简称刺络组)。刺络组在脑缺血后立即用三棱针按少商、商阳、中冲、关冲、少冲、少泽的顺序，先左前肢，后右前肢，点刺穴位，使出一滴血，以不下滴为度。
1.2 脑缺血模型的制备
参照Longa[5]法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型。用10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)、翼腭动脉(PPA)，结扎PPA、ECA及CCA近心端，于远心端备线，CCA近分叉处切口，用0.2mm的尼龙线从CCA分叉处插进颈内动脉约18±0.5mm，直至大脑前动脉，阻断大脑中动脉，引起大脑中动脉供血部位的局灶性脑缺血。假手术组手术程序同上，但不插线。
1.3 SOD活性和MDA含量的测定
取右侧大脑称重，预冷生理盐水制成10%的匀浆，3000转/分，离心15min，取上清液。按照试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所提供)说明操作，检测脑组织中SOD和MDA。
1.4 统计学处理
所有数据用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 MDA含量的变化
脑缺血30min、1h、2h、4h，脑组织中MDA含量与假手术组同期值相比明显升高(P<0.01)，刺络组脑组织MDA含量与缺血组同期值相比明显降低(P<0.01)，见表1。结果表明“手十二井穴”刺络放血可降低缺血脑组织中MDA含量。 表1 “手十二井穴”刺络放血对脑缺血大鼠缺血区脑组织MDA的影响
2.2 SOD活性的变化
脑缺血30min、1h、2h、4h，脑组织中SOD活性与假手术组同期值相比明显降低(P<0.01)，刺络组脑组织SOD活性与缺血组同期值相比明显升高(P<0.01)，见表2。结果表明：“手十二井穴”刺络放血，可提高缺血脑组织SOD活性。表2 “手十二井穴”刺络放血时对脑缺血大鼠缺血区脑组织SOD活性的影响
3 讨 论
在缺血和缺氧时，脑细胞内ATP在10~15分钟内耗尽，依靠ATP运转的离子泵因失去能量而停止运转，K+外溢，Na2+和Ca2+内流，使Ca2+大量进入脑细胞；同时细胞内酸中毒，使Na+K+ATP酶活性降低，膜的运转电位变小，Ca2+内流加剧[4]。细胞内Ca2+超负荷，从而激活依赖Ca2+的蛋白水解酶，使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，产生大量的毒性氧自由基。此外，细胞内Ca2+增加，激活了磷脂酶，使膜磷脂水解，产生大量的花生四烯酸(AA)，AA经环氧化酶代谢也可产生氧自由基[6]。氧自由基对细胞的损伤作用主要是引起生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，形成大量脂质过氧化物质，破坏膜的功能，使细胞的代谢功能发生障碍，进而使细胞死亡。超氧化物歧化酶(SOD)是体内重要的抗氧化酶，当体内自由基生成增多时，它与超氧阴离子反应形成过氧化氢，再由过氧化氢酶和谷光甘肽过氧化酶转变成水，从而使自由基清除，保护细胞免受损害。脑缺血时，由于大量氧自由基消耗了SOD，致使体内SOD降低，机体清除自由基能力下降，积累的过剩自由基与脑组织生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化连锁反应，产生大量MDA。MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧反应的代谢产物，其含量的变化可间接地反映组织中氧自由基含量的变化和组织损伤的程度。
本研究发现，大鼠局灶性脑缺血后，脑组织SOD活性降低，MDA含量升高，而“手十二井穴”刺络放血能降低缺血区脑组织MDA值，升高SOD活性。这表明“手十二井穴”刺络放血对实验性大鼠脑缺血损伤具有保护作用，其作用机理可能与其提高SOD活性、清除自由基、减轻脂质过氧化反应有关。
参考文献:
[1]张道杰,吴玉生,彭立义,等.SOD、MDA测定时补阳还五汤治疗早期缺血性中风疗效评估[J].新中医,1996，(5):117
[2]黑龙江祖医学研究所.针灸大成校译[M].北京:人民卫生出版社,1984：1117
[3]周国平,徐汤萍,王哲天.疼痛刺激在“手十二井穴”放血对家免脑血流图影响中的作用观察[J].针刺研究,1999，24(2):108
[4]马岩璠,郭义,王秀云,等.“手十二井穴”刺络放血对实验性脑缺血大鼠缺血区脑组织钙调素活性影响的实验观察[J].针刺研究,1999，24(2)：105
[5]Longa EI, Weinstein PR, Calson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989，20:84
[6]周国平,邓常表.“手十二井穴”放血抗兔实验性脑缺血机理的研究[J].针刺研究,1999，24(2):101
(咸宁学院医学院生理学教研室,湖北 咸宁 437100), http://www.100md.com(黄碧兰,余良主,刘寿仙,王帮华)
关键词：手十二井穴；刺络放血；局灶性脑缺血；超氧化物歧化酶；丙二醛
The Effects of Bloodletting Puncture in Twelvewell
Points of the Hand on Content of MDA and Activity of
SOD after Focal Cerebral Ischemia in Rats
HUANG Bilan, YU Liangzhu, LIU Shouxian,et al
(Department of Physiology, Xianning College,Xianning Hubei 437100,China)
ABSTRACT:Objective To observe the effects of bloodletting puncture in‘twelvewell points of the hand’on content of MDA and activity of SOD after focal cerebral ischemia in rats. Methods The rats were randomly divided into the sham operated group, cerebral ischemia group, bloodletting puncture in ‘twelvewell points of the hand’group. The animal models were established by middle cerebral artery occlusion (MCAO)in rats. Brain ischemia was caused by MCAO for 30min,1h,2h and 4h respectively in rats. Brain damage was measured by content of MDA and activity of SOD.Results In bloodletting puncture in ‘twelvewell point of the hand’group the content of MDA were obviously decreased whereas activity of SOD were obviously increased in comparison with those of the cerebral ischemia group(P<0.01). Conclusion Bloodletting puncture in ‘twelvewell point of the hand’has good protective effect on rat with acute brain injury by focal cerebral ischemia. The mechanism may be associated with increase of SOD activity, clearance peroxyl radical and inhibition lipid peroxidation.
KEY WORDS：Twelvewell point of the hand; Bloodletting puncture; Focal cerebral ischemia; SOD; MDA
现代研究发现[1]，自由基及其介导的脂质过氧化连锁反应是脑缺血损伤的主要原因。有效的阻止氧自由基的产生或增强其清除是脑缺血治疗的重要措施之一。“手十二井穴”刺络疗法是治疗脑缺血的一种有效急救方法[2]。有资料证明：“手十二井穴”刺络放血可使急性实验性脑缺血家兔脑血流图波幅升高，有明显扩张脑血管作用[3]，对大鼠脑缺血引起的钙调素含量升高有一定的抑制作用[4]。本实验通过制备局灶性脑缺血模型，观察“手十二井穴”刺络放血对大鼠缺血区脑组织SOD活性和MDA含量的影响，以探讨“手十二井穴”刺络放血抗脑缺血的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
健康Wistar大鼠，雌雄不拘，体重250~300g(由本院实验动物中心提供)。动物随机分为三组：假手术组、缺血组、“手十二井穴”刺络放血组(简称刺络组)。刺络组在脑缺血后立即用三棱针按少商、商阳、中冲、关冲、少冲、少泽的顺序，先左前肢，后右前肢，点刺穴位，使出一滴血，以不下滴为度。
1.2 脑缺血模型的制备
参照Longa[5]法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型。用10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)、翼腭动脉(PPA)，结扎PPA、ECA及CCA近心端，于远心端备线，CCA近分叉处切口，用0.2mm的尼龙线从CCA分叉处插进颈内动脉约18±0.5mm，直至大脑前动脉，阻断大脑中动脉，引起大脑中动脉供血部位的局灶性脑缺血。假手术组手术程序同上，但不插线。
1.3 SOD活性和MDA含量的测定
取右侧大脑称重，预冷生理盐水制成10%的匀浆，3000转/分，离心15min，取上清液。按照试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所提供)说明操作，检测脑组织中SOD和MDA。
1.4 统计学处理
所有数据用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 MDA含量的变化
脑缺血30min、1h、2h、4h，脑组织中MDA含量与假手术组同期值相比明显升高(P<0.01)，刺络组脑组织MDA含量与缺血组同期值相比明显降低(P<0.01)，见表1。结果表明“手十二井穴”刺络放血可降低缺血脑组织中MDA含量。 表1 “手十二井穴”刺络放血对脑缺血大鼠缺血区脑组织MDA的影响
2.2 SOD活性的变化
脑缺血30min、1h、2h、4h，脑组织中SOD活性与假手术组同期值相比明显降低(P<0.01)，刺络组脑组织SOD活性与缺血组同期值相比明显升高(P<0.01)，见表2。结果表明：“手十二井穴”刺络放血，可提高缺血脑组织SOD活性。表2 “手十二井穴”刺络放血时对脑缺血大鼠缺血区脑组织SOD活性的影响
3 讨 论
在缺血和缺氧时，脑细胞内ATP在10~15分钟内耗尽，依靠ATP运转的离子泵因失去能量而停止运转，K+外溢，Na2+和Ca2+内流，使Ca2+大量进入脑细胞；同时细胞内酸中毒，使Na+K+ATP酶活性降低，膜的运转电位变小，Ca2+内流加剧[4]。细胞内Ca2+超负荷，从而激活依赖Ca2+的蛋白水解酶，使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，产生大量的毒性氧自由基。此外，细胞内Ca2+增加，激活了磷脂酶，使膜磷脂水解，产生大量的花生四烯酸(AA)，AA经环氧化酶代谢也可产生氧自由基[6]。氧自由基对细胞的损伤作用主要是引起生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，形成大量脂质过氧化物质，破坏膜的功能，使细胞的代谢功能发生障碍，进而使细胞死亡。超氧化物歧化酶(SOD)是体内重要的抗氧化酶，当体内自由基生成增多时，它与超氧阴离子反应形成过氧化氢，再由过氧化氢酶和谷光甘肽过氧化酶转变成水，从而使自由基清除，保护细胞免受损害。脑缺血时，由于大量氧自由基消耗了SOD，致使体内SOD降低，机体清除自由基能力下降，积累的过剩自由基与脑组织生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化连锁反应，产生大量MDA。MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧反应的代谢产物，其含量的变化可间接地反映组织中氧自由基含量的变化和组织损伤的程度。
本研究发现，大鼠局灶性脑缺血后，脑组织SOD活性降低，MDA含量升高，而“手十二井穴”刺络放血能降低缺血区脑组织MDA值，升高SOD活性。这表明“手十二井穴”刺络放血对实验性大鼠脑缺血损伤具有保护作用，其作用机理可能与其提高SOD活性、清除自由基、减轻脂质过氧化反应有关。
参考文献:
[1]张道杰,吴玉生,彭立义,等.SOD、MDA测定时补阳还五汤治疗早期缺血性中风疗效评估[J].新中医,1996，(5):117
[2]黑龙江祖医学研究所.针灸大成校译[M].北京:人民卫生出版社,1984：1117
[3]周国平,徐汤萍,王哲天.疼痛刺激在“手十二井穴”放血对家免脑血流图影响中的作用观察[J].针刺研究,1999，24(2):108
[4]马岩璠,郭义,王秀云,等.“手十二井穴”刺络放血对实验性脑缺血大鼠缺血区脑组织钙调素活性影响的实验观察[J].针刺研究,1999，24(2)：105
[5]Longa EI, Weinstein PR, Calson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989，20:84
[6]周国平,邓常表.“手十二井穴”放血抗兔实验性脑缺血机理的研究[J].针刺研究,1999，24(2):101
(咸宁学院医学院生理学教研室,湖北 咸宁 437100), http://www.100md.com(黄碧兰,余良主,刘寿仙,王帮华)