骨髓间充质干细胞在临床应用方面的研究进展
[关键词]骨髓间充质干细胞；细胞移植；细胞治疗；归巢机制
骨髓内的结缔组织干细胞被称为骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，在分离培养的早期，其形状呈成纤维细胞样，所以又称之为“成纤维细胞集落形成单位(colonyforming unitfibroblastic，CFUF)”。许多研究显示，骨髓以外的其他器官中也广泛存在着结缔组织干细胞，体内所有这类干细胞统称为间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，骨髓基质内的MSCs是MSCs大家族的主要成员亚类。随着MSCs在组织工程、细胞移植、基因治疗等临床应用方面的深入研究，以下几个问题是应当受到重视的：MSCs的快速分离及纯化、宿主免疫反应、归巢及体内分化过程，现就此作一简要综述。
1 纯MSCs的获得及鉴定
1.1 MSCs的分离方法
目前分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法、贴壁筛选法及免疫磁珠分离法。密度梯度离心法是利用骨髓在分离液中经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。目前较常用的分离液有Percoll液和淋巴细胞分离液。Pittenger等[1]利用流式细胞仪检测密度梯度培养的第1代和第2代MSCs的均质性可达95%和98%，获得纯的MSCs较为困难。贴壁筛选法是利用MSCs黏附生长而血细胞漂浮生长的特性差异,去除漂浮生长的细胞,收集贴壁生长的MSCs，其纯度可达95%。在实际工作中多与前种方法联合应用，操作简单，经过精细筛选可以提高纯度。免疫磁珠分离法基于抗体对细胞表面抗原的特异识别，将偶联在抗体上的磁珠标记于细胞上，在磁场作用下达到分离细胞的目的。本法技术要求较高,仪器和试剂价格昂贵,尚不能推广普及,主要应用于探索MSCs特异表面标志物的实验研究。免疫磁珠分离法是目前获得原代MSCs纯度最高的方法，这种方法的缺点是对细胞活性有一定的影响。
由于BMSCs数目少，分离纯化有一定的困难，分离的细胞中常包括多种祖细胞，与干细胞很难区别。目前多用前两种方法，细胞的黏附特性仍是分离和纯化MSCs的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离MSCs的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。
1.2 MSCs的鉴定
到目前为止，有发现MSCs特异的表面标记物,对MSCs的鉴定也没有统一标准，现在普遍认为MSCs不表达造血细胞和内皮细胞表面分子。
STRO1可以作为一个识别MSCs的单克隆抗体。1991年，Simmons等[2]发现骨髓单核细胞中形成CFUF的均为STRO1+细胞；长期体外培养发现STRO1+细胞具有多分化潜能，并对体外培养的造血细胞起支持作用。1992年，Haynesworth等[3]用人骨髓基质细胞免疫小鼠筛选出3个杂交瘤系SH2、SH3、SH4，其产生的抗体识别人MSCs。用流式细胞仪对培养的人MSCs进行鉴定发现培养至第14天的MSCs仍为SH2、SH3阳性，而CD14、CD34、CD45等造血系统标志物检测均为阴性。SH2抗体可识别人MSCs转化生长因子β受体endoglin(CD105),可应用免疫磁珠分离技术来分离人MSCs,不与骨髓造血细胞、骨髓基质成纤维细胞反应，也不与成骨细胞和骨细胞反应。SH3和SH4这两种抗体均能识别MSCs膜结合5′末端核苷酸外切酶[4]。SB10抗体可以作用于未分化MSCs的表面抗原，这种抗原在细胞开始骨分化时消失，并在细胞表面表达碱性磷酸酶，这种特异性的SB10抗原被称为活性白细胞黏附分子(ALCAM,CD166)，它在MSCs向骨分化的进程中起重要作用。
2 宿主免疫反应
MSCs的免疫学特性研究大多建立在体外细胞培养的基础上，大量的实验证明它具有诱导免疫耐受和免疫抑制的特性，可抑制移植物抗宿主病(GVHD)的发生。
研究发现MSCs能够抑制混合淋巴细胞反应(MLRs)，包括自体的或同种异体T细胞或树突状细胞，这是因为MSCs表面并不表达MHCⅡ类抗原以及激活T淋巴细胞所必需的协同刺激分子,如B71,B72,CD40等。MSCs即使经γ干扰素(IFNγ)处理也不能激发共同培养的同种异体外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC) 的增生反应。因为IFNγ可上调Ⅰ类分子表达并可诱导Ⅱ类分子表达，而不改变协同刺激分子的表达，而MSCs表达的MHCⅠ分子可激活T淋巴细胞提供第一信号，但由于缺乏协同刺激分子，不能产生第二信号，故将导致T淋巴细胞无能，从而诱导免疫耐受[5]。
体外实验还表明MSCs不能作为专职抗原递呈细胞诱导同种异体淋巴细胞反应,甚至抑制丝裂原诱导的或同种异体混合淋巴细胞反应。Krampera等[6]还发现,MSCs可抑制初始T细胞和记忆T细胞对特异抗原肽反应，包括抑制T细胞增殖、抑制特异细胞毒反应,尤其是抑制IFNγ产生。上述结果提示,MSCs可能通过抑制同种反应T细胞的激活,尤其是抑制TH1类细胞因子的产生以及效应T细胞的作用来降低GVHD的发生。目前认为，MSCs的这种免疫抑制作用的机制主要是通过释放具有抑制作用的可溶因子调节的结果。di Nicola等[5]研究发现，MSCs似乎能够通过分泌转化生长因子β(TGFβ)和肝细胞生长因子(HGF)等来抑制T细胞的免疫反应性。也有人认为这种免疫抑制作用需要细胞间的直接接触。Krampera等[6]发现MSC的抑制作用必须通过与靶细胞直接接触且这种抑制作用是可逆的,当去除MSCs或加入大量细胞因子,这种抑制作用也随之消失。
有研究证明，MSCs不能持久抑制免疫细胞的功能。当大量MSCs与骨髓共移植后可能通过抑制同种反应T细胞来降低GVHD的发生,但是随着MSCs在体内的定居,其生物学特性会有所改变,其非特异性免疫抑制作用也可能降低。虽然GVHD的发生是一系列免疫细胞激活引起的相互交织的进行性多器官损害,但是MSCs能够抑制T细胞激活的特性，可能对GVHD整个病程会有一定的抑制作用。最近的临床研究证实，供体来源的MSCs与造血干细胞共移植对急性GVHD、慢性GVHD均可起到一定的抑制作用。
3 归巢机制
多项研究证明MSCs有向缺血或损伤组织归巢的特征,其详细机制尚不清楚。Liechty等[7]在把人MSCs移植入胎羊体内的研究中发现，即使是从静脉向胎羊体内注入人MSCs，人的MSCs仍能向胎羊的创伤部位特异性迁移。近年来人们在用MSCs修复骨折、心肌损伤、缺血性脑损伤的研究中均发现了MSCs这种非凡的趋向损伤部位或缺血部位的能力。在向受伤的膝关节内注射MSCs悬液的研究中发现， MSCs能够特异性地向损伤的半月板与软骨迁移并修复创伤[8]。Chapel等[9]将自体来源的MSCs用绿色免疫荧光(eGFP)标记，连同自体来源的造血细胞一同注入被α射线照伤的灵长类动物体内进行病历对照研究，结果发现注射后82d eGFP标记的MSCs在损伤的肌肉、皮肤、骨髓、内脏中都有表达。这个实验第一次证明了MSCs在多器官严重损伤的灵长类动物体内的归巢作用，且损伤部位MSCs的量与该部位的表面形状及损伤程度有关。 另外MSCs对不同部位的损伤都有一定的修复作用。
对于MSCs这种归巢作用的机制目前尚不明确。在Wang等[10]对脑缺血动物模型的研究中发现，大脑缺血组织所分泌的单核细胞趋化因子(MCP1)能够促进注入的MSCs向创伤部位特异性地迁移。同时，在正常鼠的脑组织中未检测到MCP1的表达；而当中脑动脉闭塞时，这种趋化因子迅速增加，使得MSCs向脑损伤部位迁移。2003年，Rombouts等[11]对MSCs这种归巢能力做了系统的研究，他们发现原代MSCs进行全身输注移植后，大部分能在肺脏和肝脏中检测到，但在骨髓和脾脏中几乎不能检测到。而MSCs在体外经过短时间(12～24h)培养再进行全身输注移植后，只有10%的供体MSCs在受体体内检测到。MSCs体外培养后“归巢” 能力丧失的基本机制尚不明确，有学者认为体外培养过程中MSCs的化学因子受体或黏附分子改变会影响“归巢”能力，体外培养过程中SH3、ICANI、整合素β1和细胞外基质分子合成减少也影响“归巢”能力。2005年，Bentzon等[12]研究发现人MSCs逆转录基因端粒酶(HMSCTERT)对MSCs的归巢和植活有重大意义。
目前认为,MSCs归巢是由黏附分子和趋化分子介导的,该过程有骨髓内皮细胞、造血干细胞、骨髓造血微环境及其分泌或表达的分子共同参与。目前已知免疫球蛋白超家族、选择素家族、整合素家族、CD44四大类黏附分子均参与了该过程。
4 植入细胞在体内微环境下的定向分化
MSCs治疗最基本的原则是,MSCs输入宿主体内在特定部位的微环境影响下能向正确表型的细胞分化。研究表明,MSCs定居到损伤组织后可根据所处微环境而产生定向分化,成为骨细胞、心肌细胞、肝细胞或神经细胞等。研究人员发现将MSCs移植到鼠的心脏后,干细胞有肌球蛋白重链的表达,形成收缩蛋白,表明已向心肌细胞分化。更为重要的是在移植细胞和宿主细胞间有connexin43存在,提示两者间形成了缝隙连接。这些缝隙连接是connexin43的六聚物,允许细胞间交换离子和小分子。同时也证明了MSCs有依赖环境的定向分化能力。Arinzeh等[13]也通过放射和组织学两种方法证明植入骨损伤处的MSCs可分化成为骨细胞。Orlic等[14]将Lin(-)、Ckit(+)的原始骨髓干细胞移植到大鼠心肌梗死局部,发现移植细胞也可以分化产生心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等。Condorelli等[15]研究发现乳鼠心肌细胞与胎鼠的内皮祖细胞(EPC)共同培养,EPC可发生心肌定向分化,并且发现只有与乳鼠心肌细胞直接接触的内皮细胞方能分化为心肌细胞。这些研究提示MSCs 在心脏局部有定向分化为心肌细胞的潜能。最近,Ying等[16]将转基因雌性小鼠神经干细胞或MSCs与雄性鼠胚胎干细胞混合培养,可见细胞融合现象,提示细胞融合可能是干细胞定向分化的一种合理解释。也有人推论MSCs的体内分化由特殊转录因子决定，不同的诱导条件可以决定其分化方向，可能是这些诱导条件启动了决定分化方向的转录因子。MSCs在体内分化为神经细胞的现象说明MSCs与宿主脑相互作用导致MSCs自分泌或旁分泌营养因子增加,可能有助于损伤神经功能的恢复。MSCs分泌巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、干细胞因子、TGFβ等,还产生神经细胞黏附分子(NCAM)和神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)等,这些细胞因子和神经营养因子是细胞得以存活、生长、分化的重要物质。用BDNF或NGF进行MSCs的体外培养,发现BDNF或NGF组比未用组MSCs在脑创伤鼠脑内存活数量明显增多,神经功能恢复也明显高于未用组,移植存活的细胞表达NeuN、MAP2和GFAP,可见宿主创伤部位刺激BMSs自分泌、旁分泌，促使了MSCs在体内微环境的特殊分化。
由于MSCs移植有着简单、实用、费用低和免疫排斥反应弱等优点，因此不论自体移植或异体移植，MSCs在临床都有着广阔的应用前景。当然，该领域的研究尚处于探索阶段，目前还存在很多问题有待解决：(1)对MSCs本身特性的研究，包括它的真正起源、如何能够快速获得纯的MSCs等，尚需进一步研究；(2)MSCs在体内增殖、分化的控制条件有待于进一步探索，例如，如何既控制其增殖避免肿瘤的发生，又能在适当的时候启动所需要的途径进行分化；(3)MSCs的相互作用，如MSCs与造血干细胞间相互作用、MSCs与不同成熟阶段的细胞相互作用直接对其生长、分化产生的影响等，目前还不清楚。相信如果能进一步解决MSCs的扩增和优化定向分化等问题，MSCs可安全有效地应用于临床。
[参考文献]
[1]PITTENGER M F，MACKAY A M,BECK S C,et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science,1999,284:143147.
[2]SIMMONS P J,TOROKSTORB B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody,STRO1[J]. Blood,1991,78:5562.
[3]HAYNESWORTH S E,BABER M A,CAPLAN A I. Cell surface antigens on human marrowderived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies[J]. Bone, 1992,13:6980.
[4]BARRY F,BOYNTON R,MURPHY M,et al. The SH3 and SH4 antibodies recognize distinct epitopes on CD73 from human mesenchymal stem cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2001,289:519524.
[5]di NICOLA M,CARLOSTELLA C,MAGNI M,et al. Human bone marrow stromal cells suppress Tlymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J]. Blood,2002,99,38383843.
[6]KRAMPERA M,GLENNIE S,DYSON J,et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of nal¨lve and memory antigenspecific T cells to their cognate peptide[J]. Blood,2003,101:37223729.
[7]LIECHTY K W,MACKENZIE T C,SHAABAN A F,et al. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate sitespecific differentiation after in uterotransplantation in sheep[J]. Nat Med，2000，6：12821286.
[8]SHAKE J G,GRUBER P J,BAUMGARTNER W A,et al. Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects[J]. Ann Thorac Surg,2002，73：19191925.
[9]CHAPEL A,BERTHO J M,BENSIDHOUM M,et al. Mesenchymal stem cells home to injured tissues when coinfused with hematopoietic cells to treat a radiationinduced multiorgan failure syndrome[J]. J Gene Med,2003，5:10281038.
[10]WANG L,LI Y,CHEN X,et al. MCP1,MIP1,IL8 and ischemic cerebral tissue enhance human bone marrow stromal cell migration in interface culture[J]. Hematology,2002，7：113117.
[11]ROMBOUTS W J,PLOEMACHER R E. Primary murine MSC show highly efficient homing to the bone marrow but lose homing ability following culture[J]. Leukemia,2003，17：160170.
[12]BENTZON J F,STENDERUP K,HANSEN F D,et al. Tissue distribution and engraftment of human mesenchymal stem cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene[J]. Biochem Biophys Res Commun，2005，330:633640.
[13]ARINZEH T L,PETER S J,ARCHAMBAULT M P,et al. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect[J]. J Bone Joint Surg,2003,85A：19271935.
[14]ORLIC D,KAJSTURA J,CHIMENTI S,et al. Bone marrow stem cells regenerate infracted myocardium[J]. Pediatr Transplant,2003,7:8688.
[15]CONDORELLI G,BORELLO U,ANGELIS D E,et al. Cardiomyocytes induce endothelial cells to transdifferentiate into cardiac muscle:implications for myocardium regeneration[J]. PNAS,2001,9:1073310738.
[16]YING Q L,NICHOLS J,EVANS E P. Changing potency by spontaneous fusion[J]. Nature,2002,416:545548.
(东南大学临床医学院整形外科，江苏 南京 210009), http://www.100md.com(李静,章庆国)
骨髓内的结缔组织干细胞被称为骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，在分离培养的早期，其形状呈成纤维细胞样，所以又称之为“成纤维细胞集落形成单位(colonyforming unitfibroblastic，CFUF)”。许多研究显示，骨髓以外的其他器官中也广泛存在着结缔组织干细胞，体内所有这类干细胞统称为间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，骨髓基质内的MSCs是MSCs大家族的主要成员亚类。随着MSCs在组织工程、细胞移植、基因治疗等临床应用方面的深入研究，以下几个问题是应当受到重视的：MSCs的快速分离及纯化、宿主免疫反应、归巢及体内分化过程，现就此作一简要综述。
1 纯MSCs的获得及鉴定
1.1 MSCs的分离方法
目前分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法、贴壁筛选法及免疫磁珠分离法。密度梯度离心法是利用骨髓在分离液中经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。目前较常用的分离液有Percoll液和淋巴细胞分离液。Pittenger等[1]利用流式细胞仪检测密度梯度培养的第1代和第2代MSCs的均质性可达95%和98%，获得纯的MSCs较为困难。贴壁筛选法是利用MSCs黏附生长而血细胞漂浮生长的特性差异,去除漂浮生长的细胞,收集贴壁生长的MSCs，其纯度可达95%。在实际工作中多与前种方法联合应用，操作简单，经过精细筛选可以提高纯度。免疫磁珠分离法基于抗体对细胞表面抗原的特异识别，将偶联在抗体上的磁珠标记于细胞上，在磁场作用下达到分离细胞的目的。本法技术要求较高,仪器和试剂价格昂贵,尚不能推广普及,主要应用于探索MSCs特异表面标志物的实验研究。免疫磁珠分离法是目前获得原代MSCs纯度最高的方法，这种方法的缺点是对细胞活性有一定的影响。
由于BMSCs数目少，分离纯化有一定的困难，分离的细胞中常包括多种祖细胞，与干细胞很难区别。目前多用前两种方法，细胞的黏附特性仍是分离和纯化MSCs的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离MSCs的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。
1.2 MSCs的鉴定
到目前为止，有发现MSCs特异的表面标记物,对MSCs的鉴定也没有统一标准，现在普遍认为MSCs不表达造血细胞和内皮细胞表面分子。
STRO1可以作为一个识别MSCs的单克隆抗体。1991年，Simmons等[2]发现骨髓单核细胞中形成CFUF的均为STRO1+细胞；长期体外培养发现STRO1+细胞具有多分化潜能，并对体外培养的造血细胞起支持作用。1992年，Haynesworth等[3]用人骨髓基质细胞免疫小鼠筛选出3个杂交瘤系SH2、SH3、SH4，其产生的抗体识别人MSCs。用流式细胞仪对培养的人MSCs进行鉴定发现培养至第14天的MSCs仍为SH2、SH3阳性，而CD14、CD34、CD45等造血系统标志物检测均为阴性。SH2抗体可识别人MSCs转化生长因子β受体endoglin(CD105),可应用免疫磁珠分离技术来分离人MSCs,不与骨髓造血细胞、骨髓基质成纤维细胞反应，也不与成骨细胞和骨细胞反应。SH3和SH4这两种抗体均能识别MSCs膜结合5′末端核苷酸外切酶[4]。SB10抗体可以作用于未分化MSCs的表面抗原，这种抗原在细胞开始骨分化时消失，并在细胞表面表达碱性磷酸酶，这种特异性的SB10抗原被称为活性白细胞黏附分子(ALCAM,CD166)，它在MSCs向骨分化的进程中起重要作用。
2 宿主免疫反应
MSCs的免疫学特性研究大多建立在体外细胞培养的基础上，大量的实验证明它具有诱导免疫耐受和免疫抑制的特性，可抑制移植物抗宿主病(GVHD)的发生。
研究发现MSCs能够抑制混合淋巴细胞反应(MLRs)，包括自体的或同种异体T细胞或树突状细胞，这是因为MSCs表面并不表达MHCⅡ类抗原以及激活T淋巴细胞所必需的协同刺激分子,如B71,B72,CD40等。MSCs即使经γ干扰素(IFNγ)处理也不能激发共同培养的同种异体外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC) 的增生反应。因为IFNγ可上调Ⅰ类分子表达并可诱导Ⅱ类分子表达，而不改变协同刺激分子的表达，而MSCs表达的MHCⅠ分子可激活T淋巴细胞提供第一信号，但由于缺乏协同刺激分子，不能产生第二信号，故将导致T淋巴细胞无能，从而诱导免疫耐受[5]。
体外实验还表明MSCs不能作为专职抗原递呈细胞诱导同种异体淋巴细胞反应,甚至抑制丝裂原诱导的或同种异体混合淋巴细胞反应。Krampera等[6]还发现,MSCs可抑制初始T细胞和记忆T细胞对特异抗原肽反应，包括抑制T细胞增殖、抑制特异细胞毒反应,尤其是抑制IFNγ产生。上述结果提示,MSCs可能通过抑制同种反应T细胞的激活,尤其是抑制TH1类细胞因子的产生以及效应T细胞的作用来降低GVHD的发生。目前认为，MSCs的这种免疫抑制作用的机制主要是通过释放具有抑制作用的可溶因子调节的结果。di Nicola等[5]研究发现，MSCs似乎能够通过分泌转化生长因子β(TGFβ)和肝细胞生长因子(HGF)等来抑制T细胞的免疫反应性。也有人认为这种免疫抑制作用需要细胞间的直接接触。Krampera等[6]发现MSC的抑制作用必须通过与靶细胞直接接触且这种抑制作用是可逆的,当去除MSCs或加入大量细胞因子,这种抑制作用也随之消失。
有研究证明，MSCs不能持久抑制免疫细胞的功能。当大量MSCs与骨髓共移植后可能通过抑制同种反应T细胞来降低GVHD的发生,但是随着MSCs在体内的定居,其生物学特性会有所改变,其非特异性免疫抑制作用也可能降低。虽然GVHD的发生是一系列免疫细胞激活引起的相互交织的进行性多器官损害,但是MSCs能够抑制T细胞激活的特性，可能对GVHD整个病程会有一定的抑制作用。最近的临床研究证实，供体来源的MSCs与造血干细胞共移植对急性GVHD、慢性GVHD均可起到一定的抑制作用。
3 归巢机制
多项研究证明MSCs有向缺血或损伤组织归巢的特征,其详细机制尚不清楚。Liechty等[7]在把人MSCs移植入胎羊体内的研究中发现，即使是从静脉向胎羊体内注入人MSCs，人的MSCs仍能向胎羊的创伤部位特异性迁移。近年来人们在用MSCs修复骨折、心肌损伤、缺血性脑损伤的研究中均发现了MSCs这种非凡的趋向损伤部位或缺血部位的能力。在向受伤的膝关节内注射MSCs悬液的研究中发现， MSCs能够特异性地向损伤的半月板与软骨迁移并修复创伤[8]。Chapel等[9]将自体来源的MSCs用绿色免疫荧光(eGFP)标记，连同自体来源的造血细胞一同注入被α射线照伤的灵长类动物体内进行病历对照研究，结果发现注射后82d eGFP标记的MSCs在损伤的肌肉、皮肤、骨髓、内脏中都有表达。这个实验第一次证明了MSCs在多器官严重损伤的灵长类动物体内的归巢作用，且损伤部位MSCs的量与该部位的表面形状及损伤程度有关。 另外MSCs对不同部位的损伤都有一定的修复作用。
对于MSCs这种归巢作用的机制目前尚不明确。在Wang等[10]对脑缺血动物模型的研究中发现，大脑缺血组织所分泌的单核细胞趋化因子(MCP1)能够促进注入的MSCs向创伤部位特异性地迁移。同时，在正常鼠的脑组织中未检测到MCP1的表达；而当中脑动脉闭塞时，这种趋化因子迅速增加，使得MSCs向脑损伤部位迁移。2003年，Rombouts等[11]对MSCs这种归巢能力做了系统的研究，他们发现原代MSCs进行全身输注移植后，大部分能在肺脏和肝脏中检测到，但在骨髓和脾脏中几乎不能检测到。而MSCs在体外经过短时间(12～24h)培养再进行全身输注移植后，只有10%的供体MSCs在受体体内检测到。MSCs体外培养后“归巢” 能力丧失的基本机制尚不明确，有学者认为体外培养过程中MSCs的化学因子受体或黏附分子改变会影响“归巢”能力，体外培养过程中SH3、ICANI、整合素β1和细胞外基质分子合成减少也影响“归巢”能力。2005年，Bentzon等[12]研究发现人MSCs逆转录基因端粒酶(HMSCTERT)对MSCs的归巢和植活有重大意义。
目前认为,MSCs归巢是由黏附分子和趋化分子介导的,该过程有骨髓内皮细胞、造血干细胞、骨髓造血微环境及其分泌或表达的分子共同参与。目前已知免疫球蛋白超家族、选择素家族、整合素家族、CD44四大类黏附分子均参与了该过程。
4 植入细胞在体内微环境下的定向分化
MSCs治疗最基本的原则是,MSCs输入宿主体内在特定部位的微环境影响下能向正确表型的细胞分化。研究表明,MSCs定居到损伤组织后可根据所处微环境而产生定向分化,成为骨细胞、心肌细胞、肝细胞或神经细胞等。研究人员发现将MSCs移植到鼠的心脏后,干细胞有肌球蛋白重链的表达,形成收缩蛋白,表明已向心肌细胞分化。更为重要的是在移植细胞和宿主细胞间有connexin43存在,提示两者间形成了缝隙连接。这些缝隙连接是connexin43的六聚物,允许细胞间交换离子和小分子。同时也证明了MSCs有依赖环境的定向分化能力。Arinzeh等[13]也通过放射和组织学两种方法证明植入骨损伤处的MSCs可分化成为骨细胞。Orlic等[14]将Lin(-)、Ckit(+)的原始骨髓干细胞移植到大鼠心肌梗死局部,发现移植细胞也可以分化产生心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等。Condorelli等[15]研究发现乳鼠心肌细胞与胎鼠的内皮祖细胞(EPC)共同培养,EPC可发生心肌定向分化,并且发现只有与乳鼠心肌细胞直接接触的内皮细胞方能分化为心肌细胞。这些研究提示MSCs 在心脏局部有定向分化为心肌细胞的潜能。最近,Ying等[16]将转基因雌性小鼠神经干细胞或MSCs与雄性鼠胚胎干细胞混合培养,可见细胞融合现象,提示细胞融合可能是干细胞定向分化的一种合理解释。也有人推论MSCs的体内分化由特殊转录因子决定，不同的诱导条件可以决定其分化方向，可能是这些诱导条件启动了决定分化方向的转录因子。MSCs在体内分化为神经细胞的现象说明MSCs与宿主脑相互作用导致MSCs自分泌或旁分泌营养因子增加,可能有助于损伤神经功能的恢复。MSCs分泌巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、干细胞因子、TGFβ等,还产生神经细胞黏附分子(NCAM)和神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)等,这些细胞因子和神经营养因子是细胞得以存活、生长、分化的重要物质。用BDNF或NGF进行MSCs的体外培养,发现BDNF或NGF组比未用组MSCs在脑创伤鼠脑内存活数量明显增多,神经功能恢复也明显高于未用组,移植存活的细胞表达NeuN、MAP2和GFAP,可见宿主创伤部位刺激BMSs自分泌、旁分泌，促使了MSCs在体内微环境的特殊分化。
由于MSCs移植有着简单、实用、费用低和免疫排斥反应弱等优点，因此不论自体移植或异体移植，MSCs在临床都有着广阔的应用前景。当然，该领域的研究尚处于探索阶段，目前还存在很多问题有待解决：(1)对MSCs本身特性的研究，包括它的真正起源、如何能够快速获得纯的MSCs等，尚需进一步研究；(2)MSCs在体内增殖、分化的控制条件有待于进一步探索，例如，如何既控制其增殖避免肿瘤的发生，又能在适当的时候启动所需要的途径进行分化；(3)MSCs的相互作用，如MSCs与造血干细胞间相互作用、MSCs与不同成熟阶段的细胞相互作用直接对其生长、分化产生的影响等，目前还不清楚。相信如果能进一步解决MSCs的扩增和优化定向分化等问题，MSCs可安全有效地应用于临床。
[参考文献]
[1]PITTENGER M F，MACKAY A M,BECK S C,et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J]. Science,1999,284:143147.
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(东南大学临床医学院整形外科，江苏 南京 210009), http://www.100md.com(李静,章庆国)