奥硝唑氯化钠注射液细菌内毒素的检测
摘 要 目的：建立快速的奥硝唑氯化钠注射液细菌内毒素检查法，替代热原检查法。方法：用不同厂家的鲎试剂对不同批号的奥硝唑氯化钠注射液分别进行干扰试验，考察确立奥硝唑氯化钠注射液内毒素检查法。结果：奥硝唑氯化钠注射液对细菌内毒素检查法无干扰。结论：利用细菌内毒素检查法代替奥硝唑氯化钠注射液热原检查是可行的。
关键词 奥硝唑氯化钠注射液；细菌内毒素； 鲎试剂
Bacterial endotoxin test for ornidazole and sodium chloride injection
YIN Yinjia，FANG Shuxian,DU Guang
(Department of Pharmacy,Tongji Hospital,Tongji Medical Collage,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan，Hubei 430030)
Abstract Objective:To establish bacterial endotoxin test for ornidazole and sodium chloride injection using limulus lysate agent. Method:The maximum valid dilution(MVD) was determined according to inhibition/enhancement test.Results: Ornidazole and Sodium Chloride Injection has no interference to the bacterial endotoxin. Conclusion:The result of bact erialendotoxins test is the same as that of pyrogen test.
Key words ornidazole and sodium chloride; bacterial endotoxins;limulus lysate reagent
奥硝唑是一种继甲硝唑、替硝唑之后的第三代新型硝基咪唑类衍生物，具有良好的抗厌氧菌和抗滴虫作用。奥硝唑的原药和中间代谢物均有活性，作用于厌氧菌、阿米巴虫、贾第虫和毛滴虫细胞的DNA，使其螺旋结构断裂或阻断其转录复制而致死亡。奥硝唑氯化钠注射液可用于厌氧菌感染引起的多种疾病。文献未见其细菌内毒素检测报告，为此，本文对鲎试剂检测奥硝唑氯化钠注射液中细菌内毒素的可行性进行了考察，现报告如下。
1 实验材料
微量取液器(上海金林生化试剂仪器厂)，SW-80A型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，恒温水浴箱(江苏南通嘉程仪器有限公司)。细菌内毒素检查用水(简称BET水，批号20021013，规格2 mL/支，厦门鲎试剂实验厂)，细菌内毒素工作对照品(批号20020319，规格10 EU/支，厦门鲎试剂实验厂)，鲎试剂(批号20020806，规格0.5 EU/mL，厦门鲎试剂实验厂；批号20020413，规格0.5 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司)，细菌内毒素检查用具(厦门鲎试剂实验厂)，奥硝唑氯化钠注射液(规格100 mL/瓶，南京圣药业有限公司，批号20020408，20020703，20021118)。
2 方法与结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核[1]
将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15 min，然后制成1.0、0.5、0.25、0.125 EU/mL的内毒素对照品溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 s。每一浓度平行做4支，每管加入待复核的鲎试剂0.1 mL和内毒素标准溶液0.1 mL。同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，共18管，轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入(37±1) ℃适宜恒温器中，保温(60±2)min，观察结果。同一试验均用两个批号的鲎试剂进行，结果相同。见表1。
2.2 初筛实验[2]
2.2.1 细菌内毒素限值(L)的确定[3~5]
对于奥硝唑氯化钠注射液，参考中国药典2000版及文献，确定奥硝唑氯化钠注射液M=10 mL/kg，静脉给药对人的致热阈K=5 EU/kg，依公式L=K/M，计算本品内毒素限值为L=0.5 EU/mL。表1 鲎试剂灵敏度复核试验(略)
2.2.2 内毒素工作对照品稀释液
用BET水把内毒素工作标准品稀释成1.0 EU/mL(2λ)的浓度备用。
2.2.3 供试品稀释液 计算供试品奥硝唑氯化钠注射液的稀释倍数(MVD)，MVD=L/Lλ，当Lλ＝0.5、025、0.125、0.06、0.03 EU/mL时，相应的MVD0.5=1，MVD0.25=2，MVD0.125=4，MVD0.06=8，MVD0.03=16。用BET水把供试品稀释成以上5个浓度备用。
2.2.4 加样及反应
进行供试品阴性对照(NPC)和供试品阳性对照(PPC)两个系列的反应：以上述5种供试品稀释浓度溶液作为NPC系列；PPC系列：将样品稀释成与上述NC系列相同浓度系列但在稀释过程中每一浓度样品都含有2λ内毒素。
采用灵敏度λ=0.5 EU/mL的鲎试剂分别将NC和PPC 2个系列的样品反应(37 ℃,60 min),结果见表2。表2 奥硝唑氯化钠注射液干扰预试验结果(略)
2.3 供试品干扰试验
将奥硝唑氯化钠注射液及BET水分别将细菌内毒素工作品稀释成1.0，0.5,025,0.125 EU/mL不同浓度的内毒素标准溶液，按“2.1”的方法进行实验。同一试验均用两个批号的鲎试剂进行，结果见表3。表3 供试品干扰试验结果(略)
2.4 样品细菌内毒素检查
取3批奥硝唑氯化钠注射液(每批各取5支)分别用λb=0.5 EU/mL的鲎试剂按中国药典2000年版细菌内毒素检查法检查，结果全部呈阴性。
3 讨论
实验结果表明，奥硝唑氯化钠注射液原液可用灵敏度为0.5 EU/mL的鲎试剂进行细菌内毒素检查。用不同厂家的鲎试剂对3个批号的奥硝唑氯化钠注射液进行相同浓度的重复试验，结果与上述一致。同时亦可将奥硝唑氯化钠注射液稀释2倍或4倍，用灵敏度为0.25、0.125 EU/mL的鲎试剂进行检测。
通过初步筛选试验，可以确定供试品有效稀释范围和可使用的鲎试剂灵敏度范围。从初步筛选试验确定的供试品有效稀释范围内选定一个浓度，使用相应灵敏度的鲎试剂来做干扰试验，可以减少干扰试验的盲目性，减少试剂消耗和节省时间。
参考文献
[1]中国药典(2000年版二部)[S].附录86-87.
[2]EP Supplement[S].2001.41-43.
[3]黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志，1997，32(2)：72.
[4]于庆华.右旋糖酐20葡萄糖注射液细菌内毒素检测[J].药物分析杂志,2001，21(4)：246.
[5]何瑞卿，陈声文.鲎试剂法检测盐酸普鲁卡因注射液中细菌内毒素含量[J].广东药学院学报，2001，17(2)：117.
(华中科技大学附属同济医院药学部，湖北 武汉 430030), http://www.100md.com(尹银嘉 方淑贤 杜光)
关键词 奥硝唑氯化钠注射液；细菌内毒素； 鲎试剂
Bacterial endotoxin test for ornidazole and sodium chloride injection
YIN Yinjia，FANG Shuxian,DU Guang
(Department of Pharmacy,Tongji Hospital,Tongji Medical Collage,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan，Hubei 430030)
Abstract Objective:To establish bacterial endotoxin test for ornidazole and sodium chloride injection using limulus lysate agent. Method:The maximum valid dilution(MVD) was determined according to inhibition/enhancement test.Results: Ornidazole and Sodium Chloride Injection has no interference to the bacterial endotoxin. Conclusion:The result of bact erialendotoxins test is the same as that of pyrogen test.
Key words ornidazole and sodium chloride; bacterial endotoxins;limulus lysate reagent
奥硝唑是一种继甲硝唑、替硝唑之后的第三代新型硝基咪唑类衍生物，具有良好的抗厌氧菌和抗滴虫作用。奥硝唑的原药和中间代谢物均有活性，作用于厌氧菌、阿米巴虫、贾第虫和毛滴虫细胞的DNA，使其螺旋结构断裂或阻断其转录复制而致死亡。奥硝唑氯化钠注射液可用于厌氧菌感染引起的多种疾病。文献未见其细菌内毒素检测报告，为此，本文对鲎试剂检测奥硝唑氯化钠注射液中细菌内毒素的可行性进行了考察，现报告如下。
1 实验材料
微量取液器(上海金林生化试剂仪器厂)，SW-80A型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，恒温水浴箱(江苏南通嘉程仪器有限公司)。细菌内毒素检查用水(简称BET水，批号20021013，规格2 mL/支，厦门鲎试剂实验厂)，细菌内毒素工作对照品(批号20020319，规格10 EU/支，厦门鲎试剂实验厂)，鲎试剂(批号20020806，规格0.5 EU/mL，厦门鲎试剂实验厂；批号20020413，规格0.5 EU/mL，湛江安度斯生物有限公司)，细菌内毒素检查用具(厦门鲎试剂实验厂)，奥硝唑氯化钠注射液(规格100 mL/瓶，南京圣药业有限公司，批号20020408，20020703，20021118)。
2 方法与结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核[1]
将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15 min，然后制成1.0、0.5、0.25、0.125 EU/mL的内毒素对照品溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 s。每一浓度平行做4支，每管加入待复核的鲎试剂0.1 mL和内毒素标准溶液0.1 mL。同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，共18管，轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入(37±1) ℃适宜恒温器中，保温(60±2)min，观察结果。同一试验均用两个批号的鲎试剂进行，结果相同。见表1。
2.2 初筛实验[2]
2.2.1 细菌内毒素限值(L)的确定[3~5]
对于奥硝唑氯化钠注射液，参考中国药典2000版及文献，确定奥硝唑氯化钠注射液M=10 mL/kg，静脉给药对人的致热阈K=5 EU/kg，依公式L=K/M，计算本品内毒素限值为L=0.5 EU/mL。表1 鲎试剂灵敏度复核试验(略)
2.2.2 内毒素工作对照品稀释液
用BET水把内毒素工作标准品稀释成1.0 EU/mL(2λ)的浓度备用。
2.2.3 供试品稀释液 计算供试品奥硝唑氯化钠注射液的稀释倍数(MVD)，MVD=L/Lλ，当Lλ＝0.5、025、0.125、0.06、0.03 EU/mL时，相应的MVD0.5=1，MVD0.25=2，MVD0.125=4，MVD0.06=8，MVD0.03=16。用BET水把供试品稀释成以上5个浓度备用。
2.2.4 加样及反应
进行供试品阴性对照(NPC)和供试品阳性对照(PPC)两个系列的反应：以上述5种供试品稀释浓度溶液作为NPC系列；PPC系列：将样品稀释成与上述NC系列相同浓度系列但在稀释过程中每一浓度样品都含有2λ内毒素。
采用灵敏度λ=0.5 EU/mL的鲎试剂分别将NC和PPC 2个系列的样品反应(37 ℃,60 min),结果见表2。表2 奥硝唑氯化钠注射液干扰预试验结果(略)
2.3 供试品干扰试验
将奥硝唑氯化钠注射液及BET水分别将细菌内毒素工作品稀释成1.0，0.5,025,0.125 EU/mL不同浓度的内毒素标准溶液，按“2.1”的方法进行实验。同一试验均用两个批号的鲎试剂进行，结果见表3。表3 供试品干扰试验结果(略)
2.4 样品细菌内毒素检查
取3批奥硝唑氯化钠注射液(每批各取5支)分别用λb=0.5 EU/mL的鲎试剂按中国药典2000年版细菌内毒素检查法检查，结果全部呈阴性。
3 讨论
实验结果表明，奥硝唑氯化钠注射液原液可用灵敏度为0.5 EU/mL的鲎试剂进行细菌内毒素检查。用不同厂家的鲎试剂对3个批号的奥硝唑氯化钠注射液进行相同浓度的重复试验，结果与上述一致。同时亦可将奥硝唑氯化钠注射液稀释2倍或4倍，用灵敏度为0.25、0.125 EU/mL的鲎试剂进行检测。
通过初步筛选试验，可以确定供试品有效稀释范围和可使用的鲎试剂灵敏度范围。从初步筛选试验确定的供试品有效稀释范围内选定一个浓度，使用相应灵敏度的鲎试剂来做干扰试验，可以减少干扰试验的盲目性，减少试剂消耗和节省时间。
参考文献
[1]中国药典(2000年版二部)[S].附录86-87.
[2]EP Supplement[S].2001.41-43.
[3]黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志，1997，32(2)：72.
[4]于庆华.右旋糖酐20葡萄糖注射液细菌内毒素检测[J].药物分析杂志,2001，21(4)：246.
[5]何瑞卿，陈声文.鲎试剂法检测盐酸普鲁卡因注射液中细菌内毒素含量[J].广东药学院学报，2001，17(2)：117.
(华中科技大学附属同济医院药学部，湖北 武汉 430030), http://www.100md.com(尹银嘉 方淑贤 杜光)