对胰岛素口腔喷剂中胰岛素稳定性的影响
摘 要 胰岛素在胰岛素口腔喷剂中处于比较复杂的体系,对pH敏感程度如何与其稳定性有密切关系。本文在pH 8、9、10、11、12 5个梯度50 ℃下同时碱解，用RP-HPLC方法，检测出胰岛素在口腔喷剂中的碱性降解点为pH 11左右。HPLC条件：流动相，V(乙腈)∶V(磷酸盐缓冲液，pH 3.0)=27∶73；流速，1 mL/min；进样量，20 μL。
关键词 胰岛素;口腔喷剂;pH值
SHEN Xiqun, GAO Qiuhua, CHEN Zexian, XU Huibi
Dept. of Chemistry, Central China University of Sciences And Technologies,Wuhan,Hubei 430074
Abstract The stability of insulin in a complex system of Insulin Oral Spray is correlated with its susceptibility to the pH of the system. In this study, the RPHPLC method was used in the degradation test of Insulin Oral Spray. V(Acetonitrile)∶V(PBS,pH 3.0)=27∶73 was used as the moblie phase, with the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 214 nm, and the injection scale was 20 μL. The degradation test was carried out at 50 ℃ with five different pH(pH 8,pH 9,pH 10,pH 11,pH 12). It was shown that the basic degradation point of insulin in the system of Insulin Oral Spray was pH 11.
Key words insulin;oral spray;pH value
胰岛素口腔喷剂是改变胰岛素给药途径的一种新剂型，其组成总体分成赋形剂(即药物中不含胰岛素的部分)和胰岛素两部分。赋形剂对胰岛素分子的透膜起着决定性作用，但其酸碱性对胰岛素分子不能造成破坏是该制剂发挥药效的前提条件,因此探讨pH的影响对此新制剂具有重要意义。本文设计3种对比实验，发现胰岛素分子在该剂型中能够稳定存在的pH条件是pH≤10。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪(Waters公司生产)，色谱柱(大连依利特公司生产C18柱，规格：250 mm×4.6 mm)，pHS3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂生产)。胰岛素口腔喷剂(40 U/mL，华中科技大学药物所研制，批号:20000301)，胰岛素口腔喷剂赋形剂和磷酸盐缓冲液(华中科技大学药物所提供,主要成分代号是x、y、z)，胰岛素(徐州万邦生化公司生产)，其他所用试剂为国产分析纯试剂。
2 实验方法与结果
2.1 实验方法
2.1.1 药品的配制 按华中科技大学药物所提供的配方，分别用0.5 mol/L的NaOH溶液配制成pH 8、pH 9、pH 10、pH 11、pH 12的胰岛素口腔喷剂赋形剂和胰岛素口腔喷剂，然后用移液管分别移取5 mL于编号为A、B两组各5支试管中，其中A组为赋形剂组，B组为胰岛素口腔喷剂组；另取2支试管编为C组，用移液管移取胰岛素口腔喷剂各5 mL于C组的两支试管中；再取4支试管用磷酸盐缓冲液配制x、y、z和胰岛素的标准溶液。
2.1.2 药品的预处理 将A、B、C 3组样品同时在50 ℃水浴中加热2 h后，立即取出用1 mol/L HCl将A、B两组样品的pH调至与胰岛素口腔喷剂的pH一致。
2.1.3 萃取 用水饱和的正丁醇按1∶1的体积比萃取以上样品10 min，取下清液供HPLC分析。
2.1.4 HPLC定性分析 进样量为20 μL，检测波长214 nm，分别对以上样品和标准溶液进行分析。流动相，V[磷酸盐缓冲液(PBS,0.1 mol/L,pH 30)]∶V(乙腈)=73∶27；流速，1.0 mL/min；柱温，30 ℃。
2.2 实验结果
2.2.1 直接进行加热处理的样品C中有少量白色沉淀，离心去沉淀后再接其他步骤进行分析；而A、B中没有沉淀产生。
2.2.2 样品A的HPLC谱图中有3个峰，其保留时间与它们所对应的标准物质x、y、z的HPLC谱图基本一致，并且5个样品的HPLC谱图没有因pH值的不同而有明显的不同。B样品的HPLC谱图在pH 11和pH 12时与pH为8、9、10相比产生了明显变化，即在物质y、z所出现的保留峰之间产生了新的小峰，而pH 8、9、10的HPLC谱图不仅相同，而且谱图中所出现的4个峰与标准物质x、y、z和胰岛素的保留峰基本一致。C组两样品的HPLC谱图几乎完全一致，与标准物质对照无新峰产生。A、B、C样品的4种典型的HPLC谱图见图1，x、y、z、胰岛素的保留时间分别为2.17、2.86、6.81、9.17 min左右。
图1 HPLC图谱 略
3 讨论
3.1 比较A、B、C的HPLC谱图可以看出，当pH到11时，胰岛素口腔喷剂的HPLC谱图中在保留时间3～6.79 min之间，开始出现许多小峰，而样品A、C和pH为8、9、10的B组样品的HPLC谱图中都没有这些小峰，因此，可以排除这些小峰是赋形剂的降解产物或温度导致的胰岛素的降解，应该是胰岛素分子在pH 11左右开始出现的降解产物。
广东药学院学报(ACAD J GCP) 2000，16(4)第4期 盛希群等：pH对胰岛素口腔喷剂中胰岛素稳定性的影响
3.2 本文HPLC方法参考文献[1]。但考虑到在样品的处理过程中不能排除有赋形剂的降解产物出现，从而干扰HPLC的分析，因此，在对样品进行分析前用正丁醇萃取。同时为了减少醇类物质对胰岛素的变性作用，所以正丁醇用二次蒸馏水饱和。
3.3由于蛋白质的碱性降解是非定点降解[2]，因此胰岛素的降解产物，分子大小不一，反映在色谱柱上的洗脱时间也就不一致，这是许多小峰产生的根本原因。
3.4 虽然胰岛素口腔喷剂赋形剂决定着胰岛素的透粘膜作用，但在考虑提高赋形剂的透粘膜促进作用而调整其pH值的同时必须考虑到胰岛素分子在赋形剂中的稳定性。根据本文的研究结果，该赋形剂pH值不宜超过10。
3.5 本文方法的一个最大特点就是在不知道赋形剂详细成分的情况下，对胰岛素口腔喷剂进行pH敏感程度的研究，因此，本文方法对多肽类激素药物新剂型降解产物的研究甚至其质检都有参考价值。
3.6 由于胰岛素是一种酸性蛋白，pH为5.3[3]，而且在胰岛素的定量分析中常采用pH 2的酸性溶液溶解胰岛素作为标准溶液[4]，因此，本文未考虑胰岛素口腔喷剂对pH<7的敏感程度的影响。
参考文献
[1]李湛君,杨昭鹏,徐康森.重组人胰岛素效价测定中生物测定与理化测定的相关性验证[J].药物分析杂志,1998,18(4):241.
[2]Delhaye S and Landry J.Highperformance liquid chromatography and ultraviolet spectrophotometry for quantitation of tryptophan in barytic hydrolysates[J].Anal Biochem,1986,159:75.
[3]沈同,王镜岩主编.生物化学(上册)[M].第2版.北京：高等教育出版社,1998.198.
[4]Khaksa G,Nalini K,Bhat M and Udupa N.Highperformance liquid chromatographic determination of insulin in rat and human plasma[J].Anal Biochem,1998,260:92.
华中科技大学化学系，湖北 武汉430074, 百拇医药(盛希群 高秋华 陈泽宪 徐辉碧)
关键词 胰岛素;口腔喷剂;pH值
SHEN Xiqun, GAO Qiuhua, CHEN Zexian, XU Huibi
Dept. of Chemistry, Central China University of Sciences And Technologies,Wuhan,Hubei 430074
Abstract The stability of insulin in a complex system of Insulin Oral Spray is correlated with its susceptibility to the pH of the system. In this study, the RPHPLC method was used in the degradation test of Insulin Oral Spray. V(Acetonitrile)∶V(PBS,pH 3.0)=27∶73 was used as the moblie phase, with the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 214 nm, and the injection scale was 20 μL. The degradation test was carried out at 50 ℃ with five different pH(pH 8,pH 9,pH 10,pH 11,pH 12). It was shown that the basic degradation point of insulin in the system of Insulin Oral Spray was pH 11.
Key words insulin;oral spray;pH value
胰岛素口腔喷剂是改变胰岛素给药途径的一种新剂型，其组成总体分成赋形剂(即药物中不含胰岛素的部分)和胰岛素两部分。赋形剂对胰岛素分子的透膜起着决定性作用，但其酸碱性对胰岛素分子不能造成破坏是该制剂发挥药效的前提条件,因此探讨pH的影响对此新制剂具有重要意义。本文设计3种对比实验，发现胰岛素分子在该剂型中能够稳定存在的pH条件是pH≤10。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪(Waters公司生产)，色谱柱(大连依利特公司生产C18柱，规格：250 mm×4.6 mm)，pHS3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂生产)。胰岛素口腔喷剂(40 U/mL，华中科技大学药物所研制，批号:20000301)，胰岛素口腔喷剂赋形剂和磷酸盐缓冲液(华中科技大学药物所提供,主要成分代号是x、y、z)，胰岛素(徐州万邦生化公司生产)，其他所用试剂为国产分析纯试剂。
2 实验方法与结果
2.1 实验方法
2.1.1 药品的配制 按华中科技大学药物所提供的配方，分别用0.5 mol/L的NaOH溶液配制成pH 8、pH 9、pH 10、pH 11、pH 12的胰岛素口腔喷剂赋形剂和胰岛素口腔喷剂，然后用移液管分别移取5 mL于编号为A、B两组各5支试管中，其中A组为赋形剂组，B组为胰岛素口腔喷剂组；另取2支试管编为C组，用移液管移取胰岛素口腔喷剂各5 mL于C组的两支试管中；再取4支试管用磷酸盐缓冲液配制x、y、z和胰岛素的标准溶液。
2.1.2 药品的预处理 将A、B、C 3组样品同时在50 ℃水浴中加热2 h后，立即取出用1 mol/L HCl将A、B两组样品的pH调至与胰岛素口腔喷剂的pH一致。
2.1.3 萃取 用水饱和的正丁醇按1∶1的体积比萃取以上样品10 min，取下清液供HPLC分析。
2.1.4 HPLC定性分析 进样量为20 μL，检测波长214 nm，分别对以上样品和标准溶液进行分析。流动相，V[磷酸盐缓冲液(PBS,0.1 mol/L,pH 30)]∶V(乙腈)=73∶27；流速，1.0 mL/min；柱温，30 ℃。
2.2 实验结果
2.2.1 直接进行加热处理的样品C中有少量白色沉淀，离心去沉淀后再接其他步骤进行分析；而A、B中没有沉淀产生。
2.2.2 样品A的HPLC谱图中有3个峰，其保留时间与它们所对应的标准物质x、y、z的HPLC谱图基本一致，并且5个样品的HPLC谱图没有因pH值的不同而有明显的不同。B样品的HPLC谱图在pH 11和pH 12时与pH为8、9、10相比产生了明显变化，即在物质y、z所出现的保留峰之间产生了新的小峰，而pH 8、9、10的HPLC谱图不仅相同，而且谱图中所出现的4个峰与标准物质x、y、z和胰岛素的保留峰基本一致。C组两样品的HPLC谱图几乎完全一致，与标准物质对照无新峰产生。A、B、C样品的4种典型的HPLC谱图见图1，x、y、z、胰岛素的保留时间分别为2.17、2.86、6.81、9.17 min左右。
图1 HPLC图谱 略
3 讨论
3.1 比较A、B、C的HPLC谱图可以看出，当pH到11时，胰岛素口腔喷剂的HPLC谱图中在保留时间3～6.79 min之间，开始出现许多小峰，而样品A、C和pH为8、9、10的B组样品的HPLC谱图中都没有这些小峰，因此，可以排除这些小峰是赋形剂的降解产物或温度导致的胰岛素的降解，应该是胰岛素分子在pH 11左右开始出现的降解产物。
广东药学院学报(ACAD J GCP) 2000，16(4)第4期 盛希群等：pH对胰岛素口腔喷剂中胰岛素稳定性的影响
3.2 本文HPLC方法参考文献[1]。但考虑到在样品的处理过程中不能排除有赋形剂的降解产物出现，从而干扰HPLC的分析，因此，在对样品进行分析前用正丁醇萃取。同时为了减少醇类物质对胰岛素的变性作用，所以正丁醇用二次蒸馏水饱和。
3.3由于蛋白质的碱性降解是非定点降解[2]，因此胰岛素的降解产物，分子大小不一，反映在色谱柱上的洗脱时间也就不一致，这是许多小峰产生的根本原因。
3.4 虽然胰岛素口腔喷剂赋形剂决定着胰岛素的透粘膜作用，但在考虑提高赋形剂的透粘膜促进作用而调整其pH值的同时必须考虑到胰岛素分子在赋形剂中的稳定性。根据本文的研究结果，该赋形剂pH值不宜超过10。
3.5 本文方法的一个最大特点就是在不知道赋形剂详细成分的情况下，对胰岛素口腔喷剂进行pH敏感程度的研究，因此，本文方法对多肽类激素药物新剂型降解产物的研究甚至其质检都有参考价值。
3.6 由于胰岛素是一种酸性蛋白，pH为5.3[3]，而且在胰岛素的定量分析中常采用pH 2的酸性溶液溶解胰岛素作为标准溶液[4]，因此，本文未考虑胰岛素口腔喷剂对pH<7的敏感程度的影响。
参考文献
[1]李湛君,杨昭鹏,徐康森.重组人胰岛素效价测定中生物测定与理化测定的相关性验证[J].药物分析杂志,1998,18(4):241.
[2]Delhaye S and Landry J.Highperformance liquid chromatography and ultraviolet spectrophotometry for quantitation of tryptophan in barytic hydrolysates[J].Anal Biochem,1986,159:75.
[3]沈同,王镜岩主编.生物化学(上册)[M].第2版.北京：高等教育出版社,1998.198.
[4]Khaksa G,Nalini K,Bhat M and Udupa N.Highperformance liquid chromatographic determination of insulin in rat and human plasma[J].Anal Biochem,1998,260:92.
华中科技大学化学系，湖北 武汉430074, 百拇医药(盛希群 高秋华 陈泽宪 徐辉碧)