鱼纲动物孔鳐血红蛋白自身不相互作用的研究及其进化意义
摘 要
目的：研究一种软骨鱼系动物(孔鳐)自身血红蛋白成份的相互作用。方法：淀粉-琼脂糖混合凝胶交叉电泳。结果：孔鳐自身血红蛋白成份不相互作用。结论：本实验完善了研究室所作的“各种脊椎动物血红蛋白自身相互作用的系列研究”。同前面所进行的各种脊椎动物血红蛋白分别与人血红蛋白、胎儿血红蛋白相互作用的研究对照比较,进一步验证脊椎动物血红蛋白与各种蛋白分子在电场中的相互作用的分水岭可能位于爬行纲动物，丰富了血红蛋白分子进化理论。
关键词 血红蛋白；孔鳐；相互作用；分子进化
中图分类号 Q513+.4
The Study on Chondrichthyes(Raja porosa) Hemoglobin Component Without Self-interaction and Its Significance for Evolution of Species
ZHANG Yongqiang, YAN Xiulan, QIN Wenbin，JU Tianlin
(Laboratory of Hemoglobin，Baotou Medical College，Baotou 014010,China)
Abstract Objective: To study the self-interaction of Chondrichthyes(Raja porosa) hemoglobin component. Methods： Electrophoresis of agarose-starch mixed with gel was used in these experiments. Results: There exists no interaction in Raja porosa hemoglobin component .Conclusion:These experiments perfect the study of “self-interactionin varietiesof vertebrates hemoglobincomponent”in our laboratory. Compared with the former study ofinteractionbetween varietiesof vertebrates hemoglobinand human hemoglobin, human fetal hemoglobin(Hb F), the results support the conclusion about theboundary of interaction between vertebrates hemoglobin and kinds of protein molecule in the electric field is the Reptilia animals and enrich the theoryof hemoglobin molecular evolution.
Key words Hemoglobin ;Chondrichthyes(Raja porosa); Interaction; Molecule evolution
1991年血红蛋白研究室利用淀粉-琼脂糖混合凝胶交叉电泳技术证明，在红细胞外，人血红蛋白A与血红蛋白A2可以发生相互作用\[1\]。随后的一系列实验证明，脊椎动物中非羊膜动物的无腭纲动物盲幔、纲中软骨鱼系的条纹斑竹鲨、硬骨鱼系的鲤鱼、鲫鱼、金鱼和泥鳅，以及两栖纲动物黑斑蛙、牛蛙、花背蟾蜍均不与人HbA及HbA2发生相互作用\[2-5\]。属于羊膜动物的家兔、大白鼠、小白鼠、家鸡、家鸭、家鸽等，哺乳动物和鸟纲动物血红蛋白与人HbA及HbA2发生相互作用\[6-9\]。爬行动物中沙蜥、中华鳖血红蛋白与人HbA及HbA2可以发生相互作用。但是蝮蛇血红蛋白与人血红蛋白交叉电泳时出现多样性结果\[10\]。根据以上结果推测羊膜动物和非羊膜动物的分水岭在爬行动物(属羊膜动物)。随后的研究还表明软骨鱼系、硬骨鱼系、两栖纲动物不与胎儿血红蛋白(HbF)发生互作，而哺乳动物和鸟纲动物血红蛋白可以与HbF发生互作，爬行动物中金钱龟、中华鳖在“穿过交叉”和“兜过交叉”实验中均能与HbF发生作用，而黄脊游蛇在“穿过交叉”和“兜过交叉”实验中均不与HbF发生相互作用，进一步验证了上述假设。本文从软骨鱼系孔鳐自身血红蛋白交叉电泳的角度进行研究，观察自身血红蛋白是否发生相互作用。
1 材料与方法
1.1 血液样品的来源
孔鳐购自包头市水产品市场，心脏穿刺取血，肝素抗凝。
1.2 溶血液的制备
取孔鳐抗凝血0.5ml，2 000r/min离心除去血浆,加入2倍体积的生理盐水洗涤，2 000r/min离心沉淀后去上清，反复4~5次。向压积红细胞加入1~1.5体积蒸馏水及0.5~1体积四氯化碳,剧烈振荡5min后离心, 取上层红色溶血液备用。
1.3 电泳方法
利用本研究室自己建立并长期使用的淀粉-琼脂糖混合凝胶薄层电泳。
1.4 电泳标本加样方法
根据需要分为以下三种，(1)单排加样(非交叉电泳)：在凝胶玻璃板的一端距边缘2cm处或中央并排加样，用于比较血红蛋白电泳速度的快慢；(2)交叉电泳双排加样：前排(近阳极侧)为电泳速度相对慢的血红蛋白，后排(近阴极侧)为电泳速度相对快的血红蛋白，同时前后排各设一对照。前加样线长，后加样线短，后者成分穿过前者，称为“穿过”，反之，称为“兜过”。(3)交叉电泳直接加样：在凝胶玻璃板的一端，两个较长加样线以“X”型交叉加样，称为“直接交叉”，或称“X状交叉”，可初步判断血红蛋白是否有发生了互作。
1.5 染色方法及电泳结果保存
电泳完毕，置胶板于氨基黑10B染色液中染色2h，再转入5%乙酸漂洗液中反复漂洗直到背景为白色，晾干观察结果并保存。
1.6 结果判定
(1)“ 直接交叉”实验中原来的区带出现明显扭曲现象，为有互作；原来区带未出现扭曲现象，则为无互作。(2)“穿过交叉”试验中被穿过的区带出现明显扭曲现象且凸向阳极者为有互作，未出现扭曲现象，则为无互作。(3)“兜过交叉”实验中兜过区带出现明显扭曲现象且凸向阴极者为有互作，未出现扭曲现象，则为无互作。
2 结果
2.1 孔鳐血红蛋白“直接交叉”电泳实验
加样方法见上。电泳电压120~140V，电泳时间5~6h。结果发现孔鳐溶血液在电泳中分为五条带，分别为孔鳐Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ血红蛋白。结果发现电泳后区带未出现扭曲现象，说明没有相互作用。如图1。
2.2 孔鳐血红蛋白“兜过交叉”电泳实验
加样同上，电泳电压120~140V，电泳时间5~6h。结果发现电泳后区带未出现扭曲现象，说明未发生相互作用。如图2。
图1 孔鳐血红蛋白“直接交叉”电泳结果(略)
图2 孔鳐血红蛋白“兜过交叉”电泳结果(略)
综上所述，我们可以看出软骨鱼系孔鳐血红蛋白的各个组分之间没有发生相互作用。
3 讨论
包头医学院血红蛋白研究室对不同物种的血红蛋白在电泳中发生的一过性相互作用的研究表明，成人的HbA和HbA2之间可以发生相互作用，从脊椎动物进化角度来看，爬行纲以前的脊椎动物如无腭纲、鱼纲、两栖纲的血红蛋白与成人血红蛋白不能发生相互作用，爬行纲以后的脊椎动物如鸟纲、哺乳纲的血红蛋白与成人血红蛋白则有明显的相互作用；但爬行纲的情况则介于二者之间，有的有相互作用，有的没有，有的作用明显，有的不明显。从这一系列的研究中初步得出的结论是非羊膜动物血红蛋白与人血红蛋白不发生相互作用，刚出现羊膜卵的爬行动物与人发生或不发生相互作用，而鸟纲和哺乳纲可以与人血红蛋白发生相互作用，从而推断脊椎动物血红蛋白与各种蛋白组分在电场中的相互作用的分水岭可能位于爬行纲动物。本实验结果为孔鳐血红蛋白自身各组分之间不发生相互作用，结合本届其他同学的研究结果，从而再次证明前面的观点。
目前，血红蛋白相互作用的机制还在进一步探讨之中，基本观点认为，当两种血红蛋白在电泳时，由于残基带电荷等因素，血红蛋白四聚体发生解聚，解聚后的血红蛋白的二聚物发生一过性杂交，在电泳中表现为相互作用。杂交作用较弱的，极易解聚，在电泳过程中表现为区带的重新分离。那么这种情况的主要有以下因素决定：一是结构因素，一级结构决定蛋白质的空间结构，物种在进化过程中为了适应环境的变化(比如说从水生到陆生)，其血红蛋白在进化过程中珠蛋白的氨基酸不断发生置换来满足环境的要求，所以氨基酸置换率越高，那么血红蛋白的空间结构相差就越大，在电泳过程中就越不易发生相互作用。再者一个重要因素就是血红蛋白亚基之间结合的紧密程度，各种物种由于生活环境的不同，血红蛋白的解离程度就不同，如爬行纲动物血红蛋白在溶血后迅速结合在一起\[11\],这个因素也会影响血红蛋白的相互作用。
本次实验发现孔鳐的溶血液在储存过程中发生了变化，提取的溶血液在隔段时间再进行电泳时，原本清楚的分布区带呈现一种“涂布”分布，这与Fyhn 等人的报道一致\[12\]。推测可能是，血红蛋白自身发生了聚合作用。
血红蛋白作为基因的产物，其电泳行为显示出种属或个体特异性，利用这一特异性可能为物种的分析鉴定提供帮助，同时也可为物种的分子进化提供证据。
参考文献
[1] 秦文斌.红细胞外血红蛋白A与血红蛋白A2之间的相互作用\[J\].生物化学杂志，1991,7(5):583
[2] 折志刚，雎天林，秦文斌.无腭纲动物盲鳗血红蛋白不与人血红蛋白相互作用及其进化意义\[C\].上海:中国生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要, 2001：311
[3] 邢晓雁，秦文斌，雎天林.一种软骨鱼(条纹斑竹鲨)血红蛋白不与人血蛋白相互作用及其进化意义\[C\].上海:中国生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要,2001:311.
[4] 焦勇钢，秦文斌，雎天林软骨鱼系动物与爬行纲动物血红蛋白A2现象的研究\[J\].包头医学院学报，2005，21(2)：106.
[5] 杨冬，秦文斌，雎天林.集中两栖动物血红蛋白不与人血红蛋白相互作用及其进化意义\[C\].上海:中国生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要,2001:311.
[6] 秦良宜，秦文斌几种哺乳动物血红蛋白与人血红蛋白A2之间的相互作用\[C\]海南:第八届全国生物化学与分子生物学专题报告及论文汇编，1997:37.
[7] 孟峻，雎天林，秦文斌.家兔血红蛋白与人正常、异常血红蛋白之间相互作用的研究\[J\].生物化学杂志,1997，(专刊)：36.
[8] 武莎莎,雎天林,秦文斌.大、小鼠血红蛋白与人正常、异常血红蛋白之间相互作用的研究\[J\].生物化学杂志, 1997，(专刊):37.
[9] 邵国,雎天林,秦文斌.几种鸟类蛋白与人血红蛋白之间的相互作用的研究\[J\].包头医学院学报, 2001 ,16(2)：148.
[10] 王占黎,雎天林,秦文斌.几种爬行动物血红蛋白与人血红蛋白之间相互作用的研究\[C\].上海:中国生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要, 2001:311.
[11] Austen P,Bolling S,John RA.Polymerization of frog and turtle Hemoglobins\[J\]. Biochen,1964,51:1127.
[12] Fyhn UE, Sullivan B. Elasmobranch hemoglobins:dimerization and ploy-meration in various soecies\[J\].Comp Biochem physiol,1975,50(1):119.
包头医学院血红蛋白研究室，内蒙古 包头 014010, 百拇医药(张永强 闫秀兰 秦文斌 雎天林)
目的：研究一种软骨鱼系动物(孔鳐)自身血红蛋白成份的相互作用。方法：淀粉-琼脂糖混合凝胶交叉电泳。结果：孔鳐自身血红蛋白成份不相互作用。结论：本实验完善了研究室所作的“各种脊椎动物血红蛋白自身相互作用的系列研究”。同前面所进行的各种脊椎动物血红蛋白分别与人血红蛋白、胎儿血红蛋白相互作用的研究对照比较,进一步验证脊椎动物血红蛋白与各种蛋白分子在电场中的相互作用的分水岭可能位于爬行纲动物，丰富了血红蛋白分子进化理论。
关键词 血红蛋白；孔鳐；相互作用；分子进化
中图分类号 Q513+.4
The Study on Chondrichthyes(Raja porosa) Hemoglobin Component Without Self-interaction and Its Significance for Evolution of Species
ZHANG Yongqiang, YAN Xiulan, QIN Wenbin，JU Tianlin
(Laboratory of Hemoglobin，Baotou Medical College，Baotou 014010,China)
Abstract Objective: To study the self-interaction of Chondrichthyes(Raja porosa) hemoglobin component. Methods： Electrophoresis of agarose-starch mixed with gel was used in these experiments. Results: There exists no interaction in Raja porosa hemoglobin component .Conclusion:These experiments perfect the study of “self-interactionin varietiesof vertebrates hemoglobincomponent”in our laboratory. Compared with the former study ofinteractionbetween varietiesof vertebrates hemoglobinand human hemoglobin, human fetal hemoglobin(Hb F), the results support the conclusion about theboundary of interaction between vertebrates hemoglobin and kinds of protein molecule in the electric field is the Reptilia animals and enrich the theoryof hemoglobin molecular evolution.
Key words Hemoglobin ;Chondrichthyes(Raja porosa); Interaction; Molecule evolution
1991年血红蛋白研究室利用淀粉-琼脂糖混合凝胶交叉电泳技术证明，在红细胞外，人血红蛋白A与血红蛋白A2可以发生相互作用\[1\]。随后的一系列实验证明，脊椎动物中非羊膜动物的无腭纲动物盲幔、纲中软骨鱼系的条纹斑竹鲨、硬骨鱼系的鲤鱼、鲫鱼、金鱼和泥鳅，以及两栖纲动物黑斑蛙、牛蛙、花背蟾蜍均不与人HbA及HbA2发生相互作用\[2-5\]。属于羊膜动物的家兔、大白鼠、小白鼠、家鸡、家鸭、家鸽等，哺乳动物和鸟纲动物血红蛋白与人HbA及HbA2发生相互作用\[6-9\]。爬行动物中沙蜥、中华鳖血红蛋白与人HbA及HbA2可以发生相互作用。但是蝮蛇血红蛋白与人血红蛋白交叉电泳时出现多样性结果\[10\]。根据以上结果推测羊膜动物和非羊膜动物的分水岭在爬行动物(属羊膜动物)。随后的研究还表明软骨鱼系、硬骨鱼系、两栖纲动物不与胎儿血红蛋白(HbF)发生互作，而哺乳动物和鸟纲动物血红蛋白可以与HbF发生互作，爬行动物中金钱龟、中华鳖在“穿过交叉”和“兜过交叉”实验中均能与HbF发生作用，而黄脊游蛇在“穿过交叉”和“兜过交叉”实验中均不与HbF发生相互作用，进一步验证了上述假设。本文从软骨鱼系孔鳐自身血红蛋白交叉电泳的角度进行研究，观察自身血红蛋白是否发生相互作用。
1 材料与方法
1.1 血液样品的来源
孔鳐购自包头市水产品市场，心脏穿刺取血，肝素抗凝。
1.2 溶血液的制备
取孔鳐抗凝血0.5ml，2 000r/min离心除去血浆,加入2倍体积的生理盐水洗涤，2 000r/min离心沉淀后去上清，反复4~5次。向压积红细胞加入1~1.5体积蒸馏水及0.5~1体积四氯化碳,剧烈振荡5min后离心, 取上层红色溶血液备用。
1.3 电泳方法
利用本研究室自己建立并长期使用的淀粉-琼脂糖混合凝胶薄层电泳。
1.4 电泳标本加样方法
根据需要分为以下三种，(1)单排加样(非交叉电泳)：在凝胶玻璃板的一端距边缘2cm处或中央并排加样，用于比较血红蛋白电泳速度的快慢；(2)交叉电泳双排加样：前排(近阳极侧)为电泳速度相对慢的血红蛋白，后排(近阴极侧)为电泳速度相对快的血红蛋白，同时前后排各设一对照。前加样线长，后加样线短，后者成分穿过前者，称为“穿过”，反之，称为“兜过”。(3)交叉电泳直接加样：在凝胶玻璃板的一端，两个较长加样线以“X”型交叉加样，称为“直接交叉”，或称“X状交叉”，可初步判断血红蛋白是否有发生了互作。
1.5 染色方法及电泳结果保存
电泳完毕，置胶板于氨基黑10B染色液中染色2h，再转入5%乙酸漂洗液中反复漂洗直到背景为白色，晾干观察结果并保存。
1.6 结果判定
(1)“ 直接交叉”实验中原来的区带出现明显扭曲现象，为有互作；原来区带未出现扭曲现象，则为无互作。(2)“穿过交叉”试验中被穿过的区带出现明显扭曲现象且凸向阳极者为有互作，未出现扭曲现象，则为无互作。(3)“兜过交叉”实验中兜过区带出现明显扭曲现象且凸向阴极者为有互作，未出现扭曲现象，则为无互作。
2 结果
2.1 孔鳐血红蛋白“直接交叉”电泳实验
加样方法见上。电泳电压120~140V，电泳时间5~6h。结果发现孔鳐溶血液在电泳中分为五条带，分别为孔鳐Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ血红蛋白。结果发现电泳后区带未出现扭曲现象，说明没有相互作用。如图1。
2.2 孔鳐血红蛋白“兜过交叉”电泳实验
加样同上，电泳电压120~140V，电泳时间5~6h。结果发现电泳后区带未出现扭曲现象，说明未发生相互作用。如图2。
图1 孔鳐血红蛋白“直接交叉”电泳结果(略)
图2 孔鳐血红蛋白“兜过交叉”电泳结果(略)
综上所述，我们可以看出软骨鱼系孔鳐血红蛋白的各个组分之间没有发生相互作用。
3 讨论
包头医学院血红蛋白研究室对不同物种的血红蛋白在电泳中发生的一过性相互作用的研究表明，成人的HbA和HbA2之间可以发生相互作用，从脊椎动物进化角度来看，爬行纲以前的脊椎动物如无腭纲、鱼纲、两栖纲的血红蛋白与成人血红蛋白不能发生相互作用，爬行纲以后的脊椎动物如鸟纲、哺乳纲的血红蛋白与成人血红蛋白则有明显的相互作用；但爬行纲的情况则介于二者之间，有的有相互作用，有的没有，有的作用明显，有的不明显。从这一系列的研究中初步得出的结论是非羊膜动物血红蛋白与人血红蛋白不发生相互作用，刚出现羊膜卵的爬行动物与人发生或不发生相互作用，而鸟纲和哺乳纲可以与人血红蛋白发生相互作用，从而推断脊椎动物血红蛋白与各种蛋白组分在电场中的相互作用的分水岭可能位于爬行纲动物。本实验结果为孔鳐血红蛋白自身各组分之间不发生相互作用，结合本届其他同学的研究结果，从而再次证明前面的观点。
目前，血红蛋白相互作用的机制还在进一步探讨之中，基本观点认为，当两种血红蛋白在电泳时，由于残基带电荷等因素，血红蛋白四聚体发生解聚，解聚后的血红蛋白的二聚物发生一过性杂交，在电泳中表现为相互作用。杂交作用较弱的，极易解聚，在电泳过程中表现为区带的重新分离。那么这种情况的主要有以下因素决定：一是结构因素，一级结构决定蛋白质的空间结构，物种在进化过程中为了适应环境的变化(比如说从水生到陆生)，其血红蛋白在进化过程中珠蛋白的氨基酸不断发生置换来满足环境的要求，所以氨基酸置换率越高，那么血红蛋白的空间结构相差就越大，在电泳过程中就越不易发生相互作用。再者一个重要因素就是血红蛋白亚基之间结合的紧密程度，各种物种由于生活环境的不同，血红蛋白的解离程度就不同，如爬行纲动物血红蛋白在溶血后迅速结合在一起\[11\],这个因素也会影响血红蛋白的相互作用。
本次实验发现孔鳐的溶血液在储存过程中发生了变化，提取的溶血液在隔段时间再进行电泳时，原本清楚的分布区带呈现一种“涂布”分布，这与Fyhn 等人的报道一致\[12\]。推测可能是，血红蛋白自身发生了聚合作用。
血红蛋白作为基因的产物，其电泳行为显示出种属或个体特异性，利用这一特异性可能为物种的分析鉴定提供帮助，同时也可为物种的分子进化提供证据。
参考文献
[1] 秦文斌.红细胞外血红蛋白A与血红蛋白A2之间的相互作用\[J\].生物化学杂志，1991,7(5):583
[2] 折志刚，雎天林，秦文斌.无腭纲动物盲鳗血红蛋白不与人血红蛋白相互作用及其进化意义\[C\].上海:中国生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要, 2001：311
[3] 邢晓雁，秦文斌，雎天林.一种软骨鱼(条纹斑竹鲨)血红蛋白不与人血蛋白相互作用及其进化意义\[C\].上海:中国生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要,2001:311.
[4] 焦勇钢，秦文斌，雎天林软骨鱼系动物与爬行纲动物血红蛋白A2现象的研究\[J\].包头医学院学报，2005，21(2)：106.
[5] 杨冬，秦文斌，雎天林.集中两栖动物血红蛋白不与人血红蛋白相互作用及其进化意义\[C\].上海:中国生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要,2001:311.
[6] 秦良宜，秦文斌几种哺乳动物血红蛋白与人血红蛋白A2之间的相互作用\[C\]海南:第八届全国生物化学与分子生物学专题报告及论文汇编，1997:37.
[7] 孟峻，雎天林，秦文斌.家兔血红蛋白与人正常、异常血红蛋白之间相互作用的研究\[J\].生物化学杂志,1997，(专刊)：36.
[8] 武莎莎,雎天林,秦文斌.大、小鼠血红蛋白与人正常、异常血红蛋白之间相互作用的研究\[J\].生物化学杂志, 1997，(专刊):37.
[9] 邵国,雎天林,秦文斌.几种鸟类蛋白与人血红蛋白之间的相互作用的研究\[J\].包头医学院学报, 2001 ,16(2)：148.
[10] 王占黎,雎天林,秦文斌.几种爬行动物血红蛋白与人血红蛋白之间相互作用的研究\[C\].上海:中国生物化学与分子生物学学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要, 2001:311.
[11] Austen P,Bolling S,John RA.Polymerization of frog and turtle Hemoglobins\[J\]. Biochen,1964,51:1127.
[12] Fyhn UE, Sullivan B. Elasmobranch hemoglobins:dimerization and ploy-meration in various soecies\[J\].Comp Biochem physiol,1975,50(1):119.
包头医学院血红蛋白研究室，内蒙古 包头 014010, 百拇医药(张永强 闫秀兰 秦文斌 雎天林)