西农萨能奶山羊β酪蛋白基因5′侧序列通用表达载体的构建
Universal expression vector construction of betacasein gene 5′ flanking sequence from Xinong Saanen Dairy Goat
ZHU Jing1，LIANG KeMing2，TONG DeWen1，CHEN SuMin2，DOU ZhongYing1
1 Research Centre of Stem Cells Engineering & Technology of Shaanxi, Northwest SciTech University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100, China， 2Department of Biochemistry and Molecular Biology，School of Basic Medicine，Fourth Military Medical University，Xian 710033，China
【Abstract】AIM: To detect the promote effect of βcasein gene 5′ flanking sequence and to construct universal expression vector pcDNA3165. METHODS: ① After the βcasein gene 5′ flanking sequence with 6465 bp from pMDT/65 vector was double digested with SalⅠ/ BamHⅠ, the 6465 bp sequence was obtained.And 6465 bp sequence was inserted into pGL3Basic vector which had been double digested with XhoⅠ/BglⅡ.The new clone was named pGL3B65.② Detect the activity of pGL3B65 constructed by transient transfection in primary goat mammary gland epithelial cells.③ Insert the βcasein gene 5′ flanking sequence into XhoⅠ /BamHⅠ of the pcDNA31 vector to construct pcDNA3165 vector. RESULTS: The βcasein gene 5′ flanking sequence with 6465 bp sequence could promote luciferase reporter gene effectively. The pcDNA3165 vector was well constructed. CONCLUSION: It indicates that the cloned βcasein gene 5′ flanking sequence would have its biological function at the transcriptional level, and lay a solid foundation for constructing transgenic animals and its mammary gland bioreactor.
【Keywords】 betacasein gene 5′ flanking sequence；Xinong Saanen Dairy Goat；universal expression vector
【摘要】 目的： 检测β酪蛋白基因5′侧序列的启动BglⅡ效果及构建真核表达载体pcDNA3165.方法： 采用SalⅠ和BamHⅠ对pMDT/65双酶切，得到6465 bp的β酪蛋白基因5′侧序列；将启动子片段插入到XhoⅠ和BglⅡ双酶切后的pGL3Basic载体里；获得重组报告基因载体pGL3B65.瞬时转染西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞，检测β酪蛋白基因5′侧序列的启动效果.将β酪蛋白基因5′侧序列插入真核表达载体pcDNA31(-)的XhoⅠ和BamHⅠ位点之间，从而获得载体pcDNA3165.结果： 长度为6465 bp的β酪蛋白基因5′侧序列能有效地启动荧光素酶报告基因，并正确构建了真核表达载体pcDNA3.165.结论: 克隆的β酪蛋白基因5′侧序列在转录水平上具有生物学功能，为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了坚实的基础.
【关键词】 β酪蛋白基因5′侧序列；西农萨能奶山羊；通用表达载体
0引言
利用乳蛋白基因调控序列来调控目的基因在泌乳期乳腺上皮细胞中表达，产物随乳蛋白被分泌到乳汁中，很少进入或不进人血液中，外源基因的表达产物不影响家畜正常生理活动.β酪蛋白在山羊乳汁中的含量超过50%[1]，表明该基因启动子具有启动外源基因在转基因山羊乳腺组织中表达的能力，并能引导外源蛋白分泌到乳汁中[2].我们通过构建一种山羊β酪蛋白基因5′侧序列的通用表达载体，为进一步构建不同目的基因的乳腺生物反应器表达载体奠定基础.
1材料和方法
11材料① 质粒： 以西农萨能奶山羊乳腺组织基因组DNA为模板，通过PCR扩增β酪蛋白基因5′侧启动序列(GenBank Accession Number: AY834229).将序列克隆入pMDT18，构建pMDT/65载体(由本室保存)；荧光素酶报告基因载体pGL3Basic(购自Promega公司)；pcDNA31(-)载体(购自Promega公司);② 试剂： 各种限制性内切酶分别购自Takara，NEB，GiBco等公司；胶回收试剂盒(购自赛百盛)；感受态细胞DH5α(由本室保存)；脂质体Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)；荧光素酶测定试剂盒(Luciferase assay system.购自Promega)；基础培养液DMEM(购自Takara)，胰岛素 5 mg/L，地塞米松1 mg/L，促乳素(购自Sigma)5 mg/L，细胞裂解液，PBS等；③ 细胞： 西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞(由西北农林科技大学干细胞中心杨学义博士及李伟硕士惠赠).
12方法
121β酪蛋白基因5′侧序列的报告基因表达载体pGL3B65的构建及酶切鉴定用SalⅠ(购自GiBco)和BamHⅠ(购自Takara)将pMDT/65进行双酶切后，通过琼脂糖凝胶得到2条片段，回收分子质量较大的酶切产物，获得β酪蛋白基因5′侧序列.用XhoⅠ(购自Takara)和BglⅡ(购自Takara)将pGL3Basic进行双酶切，通过琼脂糖凝胶得到1条片段，回收片段.回收采用胶回收试剂盒并按说明书进行操作.将上述回收的两个酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，转入DH5α感受态内扩增，碱裂解法提取质粒DNA，获得重组报告基因载体pGL3B65，载体与β酪蛋白基因5′侧序列片段的连接及转化参照分子克隆.感受态细胞采用DH5α，插入片段与载体的摩尔比为5∶1.HindⅢ(购自NEB)单酶切鉴定及NcoⅠ(购自Takara)/SpeⅠ(购自NEB)双酶切鉴定.
122细胞培养西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞的原代培养条件： 基础培养液用DMEM，添加胰岛素5 g/L、地塞米松1 g/L、促乳素5 g/L, 置37℃，5 mL/L CO2条件中培养48 h.
123质粒转染将原代培养的山羊乳腺上皮细胞接种于24孔板(Costar)，05×105/孔，80%细胞融合后，采用脂质体Lipofectamine2000(1 g/L)试剂盒对pGL3B65进行转染并按说明书进行操作，pGL3Basic载体作为空白对照.
124荧光素酶活性检测采用荧光素酶测定试剂盒及推荐的操作步骤进行.收集24孔板细胞： 吸弃培养上清，用1×PBS 05 mL洗1次，每孔加入80 μL 细胞裂解液，轻轻摇晃后吸入离心管中，134 g 4℃离心5 min.吸取20 μL上清，加入20 μL荧光素底物，在TD20/20化学发光检测仪(美国TD公司)上测定相对荧光值： 延迟2 s，积分时间10 s，每个样品重复2次.
125通用表达载体pcDNA3165的构建按上述方法121，SalⅠ和BamHⅠ双酶切pMDT/65质粒，回收β酪蛋白基因5′侧启动序列片段，将此序列插入真核表达载体pcDNA31(-)的多克隆位点XhoⅠ和BamHⅠ之间，获得重组载体pcDNA3165.NcoⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定并测序.
2结果
21构建策略利用本室保存的pMDT/65质粒，采用分子克隆法，构建西农萨能奶山羊β酪蛋白基因5′侧序列的报告基因表达载体pGL3B65(Fig 1 A)和真核表达载体pcDNA3165(Fig 1 B).
图1-图2略
22重组质粒pGL3B65挑取阳性克隆，碱裂解法提取质粒DNA，采用HindⅢ及NcoⅠ/SpeⅠ对pGL3B65分别进行单酶切和双酶切，经7 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果与预期大小相符(Fig 2).
23荧光素酶活性pGL3B65和pGL3Basic分别转染西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞, 置37℃,5 mL/L CO2条件中培养48 h，其中pGL3Basic载体作为空白对照，每种重组质粒被转染3次，且每次转染均做3份平行管取均值，用荧光素酶测定试剂盒及推荐的操作步骤进行，在TD20/20化学发光检测仪(美国TD公司)上测定相对荧光值，pGL3B65和pGL3Basic转染乳腺细胞48 h后，荧光值分别为1647±312和012±010. Fig 3显示，pGL3B65转染的细胞组荧光强度较空白对照组明显增加.
图3pGL3B65载体和pGL3Basic载体在西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞中的荧光素酶活性测定结果的比较 略
24通用表达载体的构建本研究载体中山羊β酪蛋白基因5′侧序列4359 +2106 bp启动区序列，该序列保留β酪蛋白基因第一内含子、第一外显子和第二外显子及其信号肽部分，在信号肽末端引入Sgf I 酶切位点，还保留约4 kb的上游启动调控区.构建通用表达载体pcDNA3165.该表达载体包含了基本的元件： β酪蛋白基因5′端及上游区，目的基因区，含polyA信号的基因3′端及下游区，牛生长激素基因(BGH),其中polyA信号及BGH 基因由pcDNA31载体提供(Fig 4).
25构建的真核表达载体pcDNA3165用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定 挑取阳性克隆，碱裂解法提取质粒DNA，采用NcoI/BamHI对构建好的pcDNA3165进行酶切，经7 g/L琼脂糖凝胶电泳，与预期大小相符(Fig 5)，表明所构建的真核表达载体正确.
图4-图5略
3讨论
动物乳腺生物反应器属于转基因动物范畴，其核心内容是通过各种转基因技术，将乳腺组织特异性启动子驱动的外源基因，在动物乳腺组织高效表达，在乳汁中生产目的产品.用于转基因动物乳腺定位表达的调控元件主要有： β乳球蛋白(BLG)、酪蛋白(Casein)、乳清酸蛋白(WAP)和乳清白蛋白基因调控序列.虽然不同动物乳汁中乳蛋白的含量不同，但含量最高的都是酪蛋白.在羊奶中β酪蛋白含量约占总乳蛋白的50%以上[1]，表明β酪蛋白基因启动子活性很强，具有启动外源基因在转基因动物乳腺组织中表达和分泌的能力.
我们克隆得到西农萨能奶山羊β酪蛋白基因4359 +2106 bp启动区序列，该序列保留β酪蛋白基因第一内含子、第一外显子和第二外显子及其信号肽部分，还保留约4 kb的上游启动调控区.
生物信息学分析表明，内含子包含有增强子或其他顺式调控元件以及能开放染色体结构的顺式成分，能增加mRNA在核内的稳定性并提高翻译效率[3，4].许多迹象表明，增强子元件在内含子序列内，增强子主要位于第一内含子区域[5-7].包括乳腺特异核因子、怀孕特异核因子、糖皮质激素受体、孕酮激素受体的结合位点“milkbox”共有区.
我们通过启动子捕获研究表明，西农萨能奶山羊β酪蛋白基因5′侧序列含有启动子元件，并对促乳素产生应答.克隆的β酪蛋白5′侧序列在转录水平上具有生物学功能，并正确构建了通用表达载体pcDNA3165，为进一步构建转基因动物乳腺生物反应器载体奠定了坚实的基础.
【参考文献】
[1] Provot C, Persuy MA , Mercier JC . Complete sequence of the ovine betacaseinencoding gene and interspecies comparison[J]. Gene,1995;154(2):259-263.
[2] Houdebine LM.Transgenic animal bioreactors[J].Transgenic Res,2000;9(45):305-320
[3] Kang YK, Lee CS , Chung AS,et al . Prolactininducible enhancer activity of the first intron of the bovine betacasein gene[J] . Mol Cells,1998;8 (3):259-265.
[4] Kolb A .The first intron of the murine betacasein gene contains a functional promoter[J].Biochem Biophys Res Commun,2003;306(4):1099-1105.
[5] Voigtlander T , Ganten D , Bader M. Transcriptional regulation of the rat renin gene by regulatory elements in intron 1[J]. Hypertension,1999;33(1):303-311.
[6] Wang GL, Moore ML, McMillin JB. A region in the first exon/intron of rat carnitine palmitoyltransferase Ibeta is involved in enhancement of basal transcription[J].Biochem,2002;362(3):609-618.
[7] Surinya KH, Cox TC,May BK. Identication and characterization of a conserved erythroidspecific enhancer located in intron 8 of the human 5aminolevulinate synthase 2 gene[J]. Biol Chem,1998;273 (27):16798-16809.
1西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心, 陕西 杨凌 712100，2第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033
专利项目：中华人民共和国国家专利(2004100731643)
作者简介：朱婧(1981)，女(汉族)，陕西省咸阳市人.硕士生(导师窦忠英)
编辑许昌泰, 百拇医药(朱婧，梁克明，童德文，陈苏民，窦忠英)
ZHU Jing1，LIANG KeMing2，TONG DeWen1，CHEN SuMin2，DOU ZhongYing1
1 Research Centre of Stem Cells Engineering & Technology of Shaanxi, Northwest SciTech University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100, China， 2Department of Biochemistry and Molecular Biology，School of Basic Medicine，Fourth Military Medical University，Xian 710033，China
【Abstract】AIM: To detect the promote effect of βcasein gene 5′ flanking sequence and to construct universal expression vector pcDNA3165. METHODS: ① After the βcasein gene 5′ flanking sequence with 6465 bp from pMDT/65 vector was double digested with SalⅠ/ BamHⅠ, the 6465 bp sequence was obtained.And 6465 bp sequence was inserted into pGL3Basic vector which had been double digested with XhoⅠ/BglⅡ.The new clone was named pGL3B65.② Detect the activity of pGL3B65 constructed by transient transfection in primary goat mammary gland epithelial cells.③ Insert the βcasein gene 5′ flanking sequence into XhoⅠ /BamHⅠ of the pcDNA31 vector to construct pcDNA3165 vector. RESULTS: The βcasein gene 5′ flanking sequence with 6465 bp sequence could promote luciferase reporter gene effectively. The pcDNA3165 vector was well constructed. CONCLUSION: It indicates that the cloned βcasein gene 5′ flanking sequence would have its biological function at the transcriptional level, and lay a solid foundation for constructing transgenic animals and its mammary gland bioreactor.
【Keywords】 betacasein gene 5′ flanking sequence；Xinong Saanen Dairy Goat；universal expression vector
【摘要】 目的： 检测β酪蛋白基因5′侧序列的启动BglⅡ效果及构建真核表达载体pcDNA3165.方法： 采用SalⅠ和BamHⅠ对pMDT/65双酶切，得到6465 bp的β酪蛋白基因5′侧序列；将启动子片段插入到XhoⅠ和BglⅡ双酶切后的pGL3Basic载体里；获得重组报告基因载体pGL3B65.瞬时转染西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞，检测β酪蛋白基因5′侧序列的启动效果.将β酪蛋白基因5′侧序列插入真核表达载体pcDNA31(-)的XhoⅠ和BamHⅠ位点之间，从而获得载体pcDNA3165.结果： 长度为6465 bp的β酪蛋白基因5′侧序列能有效地启动荧光素酶报告基因，并正确构建了真核表达载体pcDNA3.165.结论: 克隆的β酪蛋白基因5′侧序列在转录水平上具有生物学功能，为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了坚实的基础.
【关键词】 β酪蛋白基因5′侧序列；西农萨能奶山羊；通用表达载体
0引言
利用乳蛋白基因调控序列来调控目的基因在泌乳期乳腺上皮细胞中表达，产物随乳蛋白被分泌到乳汁中，很少进入或不进人血液中，外源基因的表达产物不影响家畜正常生理活动.β酪蛋白在山羊乳汁中的含量超过50%[1]，表明该基因启动子具有启动外源基因在转基因山羊乳腺组织中表达的能力，并能引导外源蛋白分泌到乳汁中[2].我们通过构建一种山羊β酪蛋白基因5′侧序列的通用表达载体，为进一步构建不同目的基因的乳腺生物反应器表达载体奠定基础.
1材料和方法
11材料① 质粒： 以西农萨能奶山羊乳腺组织基因组DNA为模板，通过PCR扩增β酪蛋白基因5′侧启动序列(GenBank Accession Number: AY834229).将序列克隆入pMDT18，构建pMDT/65载体(由本室保存)；荧光素酶报告基因载体pGL3Basic(购自Promega公司)；pcDNA31(-)载体(购自Promega公司);② 试剂： 各种限制性内切酶分别购自Takara，NEB，GiBco等公司；胶回收试剂盒(购自赛百盛)；感受态细胞DH5α(由本室保存)；脂质体Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)；荧光素酶测定试剂盒(Luciferase assay system.购自Promega)；基础培养液DMEM(购自Takara)，胰岛素 5 mg/L，地塞米松1 mg/L，促乳素(购自Sigma)5 mg/L，细胞裂解液，PBS等；③ 细胞： 西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞(由西北农林科技大学干细胞中心杨学义博士及李伟硕士惠赠).
12方法
121β酪蛋白基因5′侧序列的报告基因表达载体pGL3B65的构建及酶切鉴定用SalⅠ(购自GiBco)和BamHⅠ(购自Takara)将pMDT/65进行双酶切后，通过琼脂糖凝胶得到2条片段，回收分子质量较大的酶切产物，获得β酪蛋白基因5′侧序列.用XhoⅠ(购自Takara)和BglⅡ(购自Takara)将pGL3Basic进行双酶切，通过琼脂糖凝胶得到1条片段，回收片段.回收采用胶回收试剂盒并按说明书进行操作.将上述回收的两个酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，转入DH5α感受态内扩增，碱裂解法提取质粒DNA，获得重组报告基因载体pGL3B65，载体与β酪蛋白基因5′侧序列片段的连接及转化参照分子克隆.感受态细胞采用DH5α，插入片段与载体的摩尔比为5∶1.HindⅢ(购自NEB)单酶切鉴定及NcoⅠ(购自Takara)/SpeⅠ(购自NEB)双酶切鉴定.
122细胞培养西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞的原代培养条件： 基础培养液用DMEM，添加胰岛素5 g/L、地塞米松1 g/L、促乳素5 g/L, 置37℃，5 mL/L CO2条件中培养48 h.
123质粒转染将原代培养的山羊乳腺上皮细胞接种于24孔板(Costar)，05×105/孔，80%细胞融合后，采用脂质体Lipofectamine2000(1 g/L)试剂盒对pGL3B65进行转染并按说明书进行操作，pGL3Basic载体作为空白对照.
124荧光素酶活性检测采用荧光素酶测定试剂盒及推荐的操作步骤进行.收集24孔板细胞： 吸弃培养上清，用1×PBS 05 mL洗1次，每孔加入80 μL 细胞裂解液，轻轻摇晃后吸入离心管中，134 g 4℃离心5 min.吸取20 μL上清，加入20 μL荧光素底物，在TD20/20化学发光检测仪(美国TD公司)上测定相对荧光值： 延迟2 s，积分时间10 s，每个样品重复2次.
125通用表达载体pcDNA3165的构建按上述方法121，SalⅠ和BamHⅠ双酶切pMDT/65质粒，回收β酪蛋白基因5′侧启动序列片段，将此序列插入真核表达载体pcDNA31(-)的多克隆位点XhoⅠ和BamHⅠ之间，获得重组载体pcDNA3165.NcoⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定并测序.
2结果
21构建策略利用本室保存的pMDT/65质粒，采用分子克隆法，构建西农萨能奶山羊β酪蛋白基因5′侧序列的报告基因表达载体pGL3B65(Fig 1 A)和真核表达载体pcDNA3165(Fig 1 B).
图1-图2略
22重组质粒pGL3B65挑取阳性克隆，碱裂解法提取质粒DNA，采用HindⅢ及NcoⅠ/SpeⅠ对pGL3B65分别进行单酶切和双酶切，经7 g/L琼脂糖凝胶电泳，结果与预期大小相符(Fig 2).
23荧光素酶活性pGL3B65和pGL3Basic分别转染西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞, 置37℃,5 mL/L CO2条件中培养48 h，其中pGL3Basic载体作为空白对照，每种重组质粒被转染3次，且每次转染均做3份平行管取均值，用荧光素酶测定试剂盒及推荐的操作步骤进行，在TD20/20化学发光检测仪(美国TD公司)上测定相对荧光值，pGL3B65和pGL3Basic转染乳腺细胞48 h后，荧光值分别为1647±312和012±010. Fig 3显示，pGL3B65转染的细胞组荧光强度较空白对照组明显增加.
图3pGL3B65载体和pGL3Basic载体在西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞中的荧光素酶活性测定结果的比较 略
24通用表达载体的构建本研究载体中山羊β酪蛋白基因5′侧序列4359 +2106 bp启动区序列，该序列保留β酪蛋白基因第一内含子、第一外显子和第二外显子及其信号肽部分，在信号肽末端引入Sgf I 酶切位点，还保留约4 kb的上游启动调控区.构建通用表达载体pcDNA3165.该表达载体包含了基本的元件： β酪蛋白基因5′端及上游区，目的基因区，含polyA信号的基因3′端及下游区，牛生长激素基因(BGH),其中polyA信号及BGH 基因由pcDNA31载体提供(Fig 4).
25构建的真核表达载体pcDNA3165用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定 挑取阳性克隆，碱裂解法提取质粒DNA，采用NcoI/BamHI对构建好的pcDNA3165进行酶切，经7 g/L琼脂糖凝胶电泳，与预期大小相符(Fig 5)，表明所构建的真核表达载体正确.
图4-图5略
3讨论
动物乳腺生物反应器属于转基因动物范畴，其核心内容是通过各种转基因技术，将乳腺组织特异性启动子驱动的外源基因，在动物乳腺组织高效表达，在乳汁中生产目的产品.用于转基因动物乳腺定位表达的调控元件主要有： β乳球蛋白(BLG)、酪蛋白(Casein)、乳清酸蛋白(WAP)和乳清白蛋白基因调控序列.虽然不同动物乳汁中乳蛋白的含量不同，但含量最高的都是酪蛋白.在羊奶中β酪蛋白含量约占总乳蛋白的50%以上[1]，表明β酪蛋白基因启动子活性很强，具有启动外源基因在转基因动物乳腺组织中表达和分泌的能力.
我们克隆得到西农萨能奶山羊β酪蛋白基因4359 +2106 bp启动区序列，该序列保留β酪蛋白基因第一内含子、第一外显子和第二外显子及其信号肽部分，还保留约4 kb的上游启动调控区.
生物信息学分析表明，内含子包含有增强子或其他顺式调控元件以及能开放染色体结构的顺式成分，能增加mRNA在核内的稳定性并提高翻译效率[3，4].许多迹象表明，增强子元件在内含子序列内，增强子主要位于第一内含子区域[5-7].包括乳腺特异核因子、怀孕特异核因子、糖皮质激素受体、孕酮激素受体的结合位点“milkbox”共有区.
我们通过启动子捕获研究表明，西农萨能奶山羊β酪蛋白基因5′侧序列含有启动子元件，并对促乳素产生应答.克隆的β酪蛋白5′侧序列在转录水平上具有生物学功能，并正确构建了通用表达载体pcDNA3165，为进一步构建转基因动物乳腺生物反应器载体奠定了坚实的基础.
【参考文献】
[1] Provot C, Persuy MA , Mercier JC . Complete sequence of the ovine betacaseinencoding gene and interspecies comparison[J]. Gene,1995;154(2):259-263.
[2] Houdebine LM.Transgenic animal bioreactors[J].Transgenic Res,2000;9(45):305-320
[3] Kang YK, Lee CS , Chung AS,et al . Prolactininducible enhancer activity of the first intron of the bovine betacasein gene[J] . Mol Cells,1998;8 (3):259-265.
[4] Kolb A .The first intron of the murine betacasein gene contains a functional promoter[J].Biochem Biophys Res Commun,2003;306(4):1099-1105.
[5] Voigtlander T , Ganten D , Bader M. Transcriptional regulation of the rat renin gene by regulatory elements in intron 1[J]. Hypertension,1999;33(1):303-311.
[6] Wang GL, Moore ML, McMillin JB. A region in the first exon/intron of rat carnitine palmitoyltransferase Ibeta is involved in enhancement of basal transcription[J].Biochem,2002;362(3):609-618.
[7] Surinya KH, Cox TC,May BK. Identication and characterization of a conserved erythroidspecific enhancer located in intron 8 of the human 5aminolevulinate synthase 2 gene[J]. Biol Chem,1998;273 (27):16798-16809.
1西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心, 陕西 杨凌 712100，2第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，陕西 西安 710033
专利项目：中华人民共和国国家专利(2004100731643)
作者简介：朱婧(1981)，女(汉族)，陕西省咸阳市人.硕士生(导师窦忠英)
编辑许昌泰, 百拇医药(朱婧，梁克明，童德文，陈苏民，窦忠英)