艾滋病病毒耐药性及其影响因素的研究
【摘要】 目的 研究艾滋病病毒HIV-1耐药毒株的出现情况及其影响因素，为艾滋病抗病毒药物的合理应用及减少耐药毒株的出现提供科学依据。 方法 采用横断面调查方法和基因型分析法对随州市接受艾滋病抗病毒治疗和未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者进行耐药性检测。 结果 共调查193例HIV-1感染者(109例接受艾滋病抗病毒治疗，84名未接受治疗)，其中病毒载量>1000copies/ml的95例PCR阳性者进行了耐药检测，未治疗、终止治疗和正在进行治疗的总耐药率分别为10.3%、25%和53.3%。 结论 基因突变是HIV耐药性产生的主要原因。接受和未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者均存在不同程度的耐药，正在接受治疗的病例耐药突变率及总的耐药相关突变率均高于未治疗的病例及已经终止治疗的病例。
【关键词】 获得性免疫缺陷综合征;药物耐受性;流行病学
Study on the resistance rate and influencing factors of HIV-1 HE Wei-hua，ZHOU Pei-lin，HE Hua-xian，ZHANG Yang，HUANG Xi-ping，WU Xiao-yun，ZHANG Shao-lan. Suizhou Center for Dis-ease Control and Prevention，Suizhou 441300，China
【Abstract】 Objective To investigate the resistance rate and influencing factors of HIV-1infected peo-ple and provide scientific evidence for antiretroviral therapy and reduce the drug-resisted stains.Methods Gene analysis and cross section investigation were conducted among193HIV-1infected patients for drug-resistance.Results Viral load PCR results of95patients were over1000copies/ml.The drug-re-sistance ratio of three groups were10.3%，25%and53.3%respectively.Conclusions The ratio of resistance and total resistance in people receiving antiretroviral therapy were significantly higher than people who didn't receive therapy and stopped antiretroviral therapy.The gene mutation was a
key fac-tor of drug-resistance.
【Key words】 Acquired immunodeficiency syndrome;Drug tolerance;Epidemiology(Chin J Dis Control Prev2006，10(3):259-261)
艾滋病抗病毒药物联合治疗的应用，有效降低了感染者血浆中获得性免疫缺陷病毒(human im-munodeficiency virus，HIV)的水平，延缓了HIV感染的进程，降低了与HIV/AIDS相关疾病的发病率和死亡率。而耐药病毒株的出现则是持续性的病毒抑制和抗病毒治疗长期效果的主要障碍之一 [1] 。随州市从2003年7月开始为艾滋病患者提供抗病毒药物联合治疗。2004年9月，该市参加中国疾病预防控制中心和军事医学科学院开展的全国范围的HIV耐药性调查。
1 治疗药物及方法
1.1 对象
随州市最早开展治疗的109名病人和84名未接受抗病毒治疗的HIV感染者，共193名。其中男性113例，女性80例，年龄38.00±1.92岁。
1.2 方法
1.2.1 研究方法
采用横断面调查，根据知情同意的原则，对自愿参加本次研究并符合入选标准的感染者按照统一的问卷进行访谈，同时进行临床体检并采集血样。于2004年9月在上海市疾病预防控制中心进行耐药性检测。
1.2.2 治疗药物及方案
艾滋病抗病毒药物有核苷类的去羟肌苷DDI、司他夫定D4T，非核苷类的依非韦仑EFV、奈韦拉平NVP。剂量:体重≥60kg者，DDI、D4T每日2次，分别为200mg、40mg;体重<60kg，DDI、D4T每日2次，分别为125mg、30mg;NVP前14天每日口服200mg，以后每日口服2次，一次200mg;EFV每日口服600mg，睡前服用。治疗方案:D4T+DDI+NVP，D4T+DDI+EFV。
1.3 耐药性检测
对HIV-RNA>1000copies/ml的病例进行虚拟表型基因分析，检测DDI、D4T、EFV、NVP的耐药状况。检测使用QIAGEN公司QIAampVi-ValRNAExtraction试剂盒提取血浆中的RNA、逆转录酶，以cDNA为模板进行巢式RT-PCR扩增，RT-PCR扩增产物纯化回收后，自动测序仪测定HIV基因序列，所得数据应用GCG软件包、Clustalx、Gene DOC等工具分析，并与美国Los Alamos国家实验室HIV Drug Resistance Database 数据库及其Standford HIV Drug Resistance Database 数据库中序列进行比较，得到样本序列与已知耐药序列的关联情况。
1.4 统计学分析
采用软件SPSS12.0，耐药频率采用计数法，不同药物和组别间耐药比较进行χ 2 检验。
2 结果
2.1 不同治疗情况的病人耐药相关突变率 在193例HIV-1感染者中，对符合病毒载量(virus load，VL)>1000copies/ml的感染者95例进行耐药检测，其中未治疗者耐药率为10.3%，终止治疗者耐药率为25%;一种方案并正在治疗者为55.6%，多种方案并正在治疗者为50.0%。经统计学分析，目前VL>1000copies/ml的艾滋病患者中，正在接受治疗的病人其高度耐药相关突变率及总的耐药突变率均高于未治疗的病人及终止治疗的病人(χ 2 =5.24，P<0.01)。
2.2 耐药情况
95例VL>1000copies/ml PCR阳性HIV-1感染者中，未治疗者68例，治疗者27例。在治疗的27例感染者中，终止治疗者12例，一种方案治疗者11例，更换方案治疗者4例。耐药突变检测情况见表1和表2。 表1 95例感染者耐药突变检测结果(略)表2 95例患者对DLV、EFV、NVP的耐药检测结果(略)
治疗组对EFV、NVP耐药率远高于未治疗组(χ 2 =5.31，P<0.01)。
2.3 终止治疗因素分析
109例抗病毒治疗者中，有17例感染者因多种原因终止治疗，占治疗者的15.60%。终止治疗原因见表3。表3 治疗停止情况分析(略)
12例病人中，有2例HIV-1感染者分别在终止治疗后的16d、42d自杀。另10例感染者继续存活，截止论文完成时，2例存活22个月，5例存活28个月，3例存活29个月。
3 讨论
本次研究对象为随州市193例未治疗及接受3种以核苷类逆转录酶抑制剂(necleoside reverse tran-scriptase inhibitor，NRTI)和非核苷类逆转录酶抑制剂(nonnecleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)的三联抗病毒治疗方案的HIV-1感染人群。接受抗病毒治疗的109例HIV-1感染者中VL>1000copies/ml有27例，占总人数的14%，未接受治疗的84例感染者中VL>1000copies/ml有68例，占总人数的35.2%。说明抗病毒治疗能有效降低VL，抑制病毒复制，从而延缓疾病的进程，降低HIV/AIDS发病率和死亡率。
随着抗病毒治疗的开展，HIV药物的耐药性也显著增加，成为导致抗病毒治疗失败的主要原因之一。基因突变是HIV耐药性产生的根源。在HIV突变株上，逆转录酶和蛋白酶基因发生突变，结果导致在相应位置上的氨基酸被其他氨基酸所取代，故酶的功能不再受药物抑制，从而使病毒自由复制，使耐药病毒株取代野生病毒株。现在常用耐药株的检测方法有HIV基因型和表型分析两种，本研究采取的是以基因型分析为基础的虚拟表型分析法，其优点是能将复杂的基因型分析结果转化为临床医务人员较为熟悉的表型资料，便于临床应用 [2] 。其缺点是只能检测VL>500copies/mm 3 的病例。本次调查是按照全国的制订的统一标准进行耐药检测，病例的VL>1000copies/ml。
本研究耐药检测发现，在VL>1000copies/ml的HIV-1感染者中，正在接受治疗的病例其高度耐药相关突变率及总的耐药相关突变率，均要高于未治疗的病例及已经终止治疗的病例，说明在选择抗病毒治疗方案时，应尽可能抑制病毒复制，使之达到 不能检出的水平，并尽可能将这种状态维持较长时间，否则将有耐药病毒株产生并成为优势病毒株，而产生耐药的可能 [3] 。研究中发现终止治疗的艾滋病患者的耐药突变低于正在治疗的艾滋病患者，证明了先前报道HIV-1中的大部分耐药变异在中断抗病毒治疗后能迅速消失 [4] 。
本次研究中多数艾滋病患者接受过服药依从性培训，故基本排除服药依从性影响。有报道NNR-TIS的体内外使用可迅速产生耐药，并产生耐药毒株。它的耐药变异发生在结合的疏水区部位，在这个部位一个基因位点的变异就能导致对一种或多种NNRTI的高度耐药 [4] 。本研究检测了95例患者对EFV、NVP的耐药性，发现全部18例耐药病例中有9例使用NNRTI药物发生耐药，说明对所有的NNRTIS耐药是相符的。
本研究中耐药检测的范围受到HIV RNA>1000copies/ml的限制，所以对病毒载量<1000copies/ml HIV-1感染者的耐药状况及其与抗病毒治疗的相关性有待进一步研究。已有报道Hermonkova等 [5] 采用改良的基因型分析方法可检测病毒载量<50copies/ml HIV-1感染者的耐药性，使对所有HIV-1感染者进行耐药检测成为可能，从而指导临床医生对高效抗逆转录病毒药物选择，前次抗病毒治疗失败后新方案的制订，HIV-1孕妇感染者的抗病毒治疗，以及为未治疗的HIV-1感染者启动抗病毒治疗提供参考 [6] 。
【参考文献】
[1]徐军强，曹韵贞.HIV-1耐药性研究的新进展[J]. 国外医学病毒学分册 ，2001，8(5):158-162.
[2]颜苹苹，严延生.HIV耐药性研究进展及其临床应用前景
[J]. 中国人兽共患病杂志 ，2003，19(1):112-115，12.
[3]余永勤，秦树林.HIV的基因突变与其耐药性[J]. 传染病信息 ，2001，14(4):156-159.
[4]邹薇，吴南屏.高效抗逆转录治疗中的耐药研究进展[J]. 国外医学流行病学传染病学分册 ，2002，29(4):195-197.
[5]Hermonkova M，Ray SC，Ruff C，et al.HIV-1drug resistance profiles in children and adults with viral load of<50copies/ml re-ceiveig combination Therapy [J].JAMA，2001，286(2):196-207.
[6]Hirsch MS，Brun-Vezinet F，DA quila RT，et al.Antiretroviral drug resistance testing in adult HIV-1Infection:recommendations of an International AIDS Society-USA panel[J].JAMA，2000，283(18):2417-2426.
【基金项目】湖北省科技攻关项目(2005AA301C50)
【作者单位】随州市疾病预防控制中心，湖北随州 441300
【作者简介】何卫华(1965-)，男，湖北随州人，副主任医师，在读博士研究生。主要研究方向:预防医学。, 百拇医药(何卫华，周沛林，何华仙，张杨，黄希平，吴晓云，张绍)
【关键词】 获得性免疫缺陷综合征;药物耐受性;流行病学
Study on the resistance rate and influencing factors of HIV-1 HE Wei-hua，ZHOU Pei-lin，HE Hua-xian，ZHANG Yang，HUANG Xi-ping，WU Xiao-yun，ZHANG Shao-lan. Suizhou Center for Dis-ease Control and Prevention，Suizhou 441300，China
【Abstract】 Objective To investigate the resistance rate and influencing factors of HIV-1infected peo-ple and provide scientific evidence for antiretroviral therapy and reduce the drug-resisted stains.Methods Gene analysis and cross section investigation were conducted among193HIV-1infected patients for drug-resistance.Results Viral load PCR results of95patients were over1000copies/ml.The drug-re-sistance ratio of three groups were10.3%，25%and53.3%respectively.Conclusions The ratio of resistance and total resistance in people receiving antiretroviral therapy were significantly higher than people who didn't receive therapy and stopped antiretroviral therapy.The gene mutation was a
key fac-tor of drug-resistance.
【Key words】 Acquired immunodeficiency syndrome;Drug tolerance;Epidemiology(Chin J Dis Control Prev2006，10(3):259-261)
艾滋病抗病毒药物联合治疗的应用，有效降低了感染者血浆中获得性免疫缺陷病毒(human im-munodeficiency virus，HIV)的水平，延缓了HIV感染的进程，降低了与HIV/AIDS相关疾病的发病率和死亡率。而耐药病毒株的出现则是持续性的病毒抑制和抗病毒治疗长期效果的主要障碍之一 [1] 。随州市从2003年7月开始为艾滋病患者提供抗病毒药物联合治疗。2004年9月，该市参加中国疾病预防控制中心和军事医学科学院开展的全国范围的HIV耐药性调查。
1 治疗药物及方法
1.1 对象
随州市最早开展治疗的109名病人和84名未接受抗病毒治疗的HIV感染者，共193名。其中男性113例，女性80例，年龄38.00±1.92岁。
1.2 方法
1.2.1 研究方法
采用横断面调查，根据知情同意的原则，对自愿参加本次研究并符合入选标准的感染者按照统一的问卷进行访谈，同时进行临床体检并采集血样。于2004年9月在上海市疾病预防控制中心进行耐药性检测。
1.2.2 治疗药物及方案
艾滋病抗病毒药物有核苷类的去羟肌苷DDI、司他夫定D4T，非核苷类的依非韦仑EFV、奈韦拉平NVP。剂量:体重≥60kg者，DDI、D4T每日2次，分别为200mg、40mg;体重<60kg，DDI、D4T每日2次，分别为125mg、30mg;NVP前14天每日口服200mg，以后每日口服2次，一次200mg;EFV每日口服600mg，睡前服用。治疗方案:D4T+DDI+NVP，D4T+DDI+EFV。
1.3 耐药性检测
对HIV-RNA>1000copies/ml的病例进行虚拟表型基因分析，检测DDI、D4T、EFV、NVP的耐药状况。检测使用QIAGEN公司QIAampVi-ValRNAExtraction试剂盒提取血浆中的RNA、逆转录酶，以cDNA为模板进行巢式RT-PCR扩增，RT-PCR扩增产物纯化回收后，自动测序仪测定HIV基因序列，所得数据应用GCG软件包、Clustalx、Gene DOC等工具分析，并与美国Los Alamos国家实验室HIV Drug Resistance Database 数据库及其Standford HIV Drug Resistance Database 数据库中序列进行比较，得到样本序列与已知耐药序列的关联情况。
1.4 统计学分析
采用软件SPSS12.0，耐药频率采用计数法，不同药物和组别间耐药比较进行χ 2 检验。
2 结果
2.1 不同治疗情况的病人耐药相关突变率 在193例HIV-1感染者中，对符合病毒载量(virus load，VL)>1000copies/ml的感染者95例进行耐药检测，其中未治疗者耐药率为10.3%，终止治疗者耐药率为25%;一种方案并正在治疗者为55.6%，多种方案并正在治疗者为50.0%。经统计学分析，目前VL>1000copies/ml的艾滋病患者中，正在接受治疗的病人其高度耐药相关突变率及总的耐药突变率均高于未治疗的病人及终止治疗的病人(χ 2 =5.24，P<0.01)。
2.2 耐药情况
95例VL>1000copies/ml PCR阳性HIV-1感染者中，未治疗者68例，治疗者27例。在治疗的27例感染者中，终止治疗者12例，一种方案治疗者11例，更换方案治疗者4例。耐药突变检测情况见表1和表2。 表1 95例感染者耐药突变检测结果(略)表2 95例患者对DLV、EFV、NVP的耐药检测结果(略)
治疗组对EFV、NVP耐药率远高于未治疗组(χ 2 =5.31，P<0.01)。
2.3 终止治疗因素分析
109例抗病毒治疗者中，有17例感染者因多种原因终止治疗，占治疗者的15.60%。终止治疗原因见表3。表3 治疗停止情况分析(略)
12例病人中，有2例HIV-1感染者分别在终止治疗后的16d、42d自杀。另10例感染者继续存活，截止论文完成时，2例存活22个月，5例存活28个月，3例存活29个月。
3 讨论
本次研究对象为随州市193例未治疗及接受3种以核苷类逆转录酶抑制剂(necleoside reverse tran-scriptase inhibitor，NRTI)和非核苷类逆转录酶抑制剂(nonnecleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)的三联抗病毒治疗方案的HIV-1感染人群。接受抗病毒治疗的109例HIV-1感染者中VL>1000copies/ml有27例，占总人数的14%，未接受治疗的84例感染者中VL>1000copies/ml有68例，占总人数的35.2%。说明抗病毒治疗能有效降低VL，抑制病毒复制，从而延缓疾病的进程，降低HIV/AIDS发病率和死亡率。
随着抗病毒治疗的开展，HIV药物的耐药性也显著增加，成为导致抗病毒治疗失败的主要原因之一。基因突变是HIV耐药性产生的根源。在HIV突变株上，逆转录酶和蛋白酶基因发生突变，结果导致在相应位置上的氨基酸被其他氨基酸所取代，故酶的功能不再受药物抑制，从而使病毒自由复制，使耐药病毒株取代野生病毒株。现在常用耐药株的检测方法有HIV基因型和表型分析两种，本研究采取的是以基因型分析为基础的虚拟表型分析法，其优点是能将复杂的基因型分析结果转化为临床医务人员较为熟悉的表型资料，便于临床应用 [2] 。其缺点是只能检测VL>500copies/mm 3 的病例。本次调查是按照全国的制订的统一标准进行耐药检测，病例的VL>1000copies/ml。
本研究耐药检测发现，在VL>1000copies/ml的HIV-1感染者中，正在接受治疗的病例其高度耐药相关突变率及总的耐药相关突变率，均要高于未治疗的病例及已经终止治疗的病例，说明在选择抗病毒治疗方案时，应尽可能抑制病毒复制，使之达到 不能检出的水平，并尽可能将这种状态维持较长时间，否则将有耐药病毒株产生并成为优势病毒株，而产生耐药的可能 [3] 。研究中发现终止治疗的艾滋病患者的耐药突变低于正在治疗的艾滋病患者，证明了先前报道HIV-1中的大部分耐药变异在中断抗病毒治疗后能迅速消失 [4] 。
本次研究中多数艾滋病患者接受过服药依从性培训，故基本排除服药依从性影响。有报道NNR-TIS的体内外使用可迅速产生耐药，并产生耐药毒株。它的耐药变异发生在结合的疏水区部位，在这个部位一个基因位点的变异就能导致对一种或多种NNRTI的高度耐药 [4] 。本研究检测了95例患者对EFV、NVP的耐药性，发现全部18例耐药病例中有9例使用NNRTI药物发生耐药，说明对所有的NNRTIS耐药是相符的。
本研究中耐药检测的范围受到HIV RNA>1000copies/ml的限制，所以对病毒载量<1000copies/ml HIV-1感染者的耐药状况及其与抗病毒治疗的相关性有待进一步研究。已有报道Hermonkova等 [5] 采用改良的基因型分析方法可检测病毒载量<50copies/ml HIV-1感染者的耐药性，使对所有HIV-1感染者进行耐药检测成为可能，从而指导临床医生对高效抗逆转录病毒药物选择，前次抗病毒治疗失败后新方案的制订，HIV-1孕妇感染者的抗病毒治疗，以及为未治疗的HIV-1感染者启动抗病毒治疗提供参考 [6] 。
【参考文献】
[1]徐军强，曹韵贞.HIV-1耐药性研究的新进展[J]. 国外医学病毒学分册 ，2001，8(5):158-162.
[2]颜苹苹，严延生.HIV耐药性研究进展及其临床应用前景
[J]. 中国人兽共患病杂志 ，2003，19(1):112-115，12.
[3]余永勤，秦树林.HIV的基因突变与其耐药性[J]. 传染病信息 ，2001，14(4):156-159.
[4]邹薇，吴南屏.高效抗逆转录治疗中的耐药研究进展[J]. 国外医学流行病学传染病学分册 ，2002，29(4):195-197.
[5]Hermonkova M，Ray SC，Ruff C，et al.HIV-1drug resistance profiles in children and adults with viral load of<50copies/ml re-ceiveig combination Therapy [J].JAMA，2001，286(2):196-207.
[6]Hirsch MS，Brun-Vezinet F，DA quila RT，et al.Antiretroviral drug resistance testing in adult HIV-1Infection:recommendations of an International AIDS Society-USA panel[J].JAMA，2000，283(18):2417-2426.
【基金项目】湖北省科技攻关项目(2005AA301C50)
【作者单位】随州市疾病预防控制中心，湖北随州 441300
【作者简介】何卫华(1965-)，男，湖北随州人，副主任医师，在读博士研究生。主要研究方向:预防医学。, 百拇医药(何卫华，周沛林，何华仙，张杨，黄希平，吴晓云，张绍)