替硝唑片在人体内生物等效性的试验观察
摘要:目的 研究替硝唑片在健康人体内的生物等效性。 方法 采用双周期两制剂交叉试验设计，单剂量口服500mg替硝唑片，用HPLC法测定血清药物浓度。 结果 试验制剂的药代动力学参数C max 、T max 、T 1/2 、AUC 0→72 分别为(12.56±3.188)ng/ml、(2.01±1.24)h、(16.03±1.69)h和(257.55±47.46)ng·h/ml与参与制剂的(12.13±2.23)ng/ml、(1.93±0.86)h、(15.79±1.88)h和(257.86±46.41)ng·h/ml差异无显著性(P>0.05)。 结论 受试制剂与参比制剂具有生物等效性。
关键词:替硝唑;生物等效性;高效液相色谱法
Experimental study on the bioequivalence of tinidazole tablet in human body.
LIN Ming-qin，KUANG Shao-yi，ZHUANG Ren-zhi.
(Hainan Medical College，Haikou571101，Hainan，P.R.China)
Abstract:Objective To observe the bioequivalence of tinidazole tablets in the healthy human body. Methods An open randomized cross-over study on the observation of single oral dose of500mg tinidazole tablets was carried out.The concentration of tinidazole in serum were determined by HPLC. Results The concentrations of C max 、T max 、T 1/2 、AUC 0→72 in the test group were(12.56±3.188)ng/ml，(2.01±1.24)ng/ml，(16.03±1.69)h and(257.55±47.46)ng/ml，while that in the control group were(12.13±2.23)ng/ml，(1.93±0.86)h，(15.79±1.88)h and(257.86±46.41)ng·h/ml，respectively.The pharmacokinetic pa-rameters of the two formulations were compared without showing significant difference(P>0.05). Conclusion The two tablets are bioequivalent.
Key words:Tinidazole;Bioequivalence;High performance liquid chromatography
替硝唑(Tinidazole，TND)化学名为2-甲基-1-[2-(乙基磺酰基)乙基]-5-硝基-1H-咪唑，与甲硝唑同属硝基咪唑类，是目前临床广范应用的强力抗厌氧菌及抗原虫感染性疾病治疗药。其口服吸收好，起效快，在体内广范分布，比甲硝唑血药浓度高，半衰期长，对各种常见的致病菌和滴虫的杀灭作用较甲硝唑强2～4倍，而毒副作用明显比甲硝唑低，特殊毒理研究表明，本品无致癌毒性。本文通过采用HPLC法测定健康志愿者血清中替硝唑的浓度，以评价海南海力制药有限公司研制的替硝唑片(受试制剂)与湖北广济药业股份有限公司生产替硝唑片(参比制剂)的生物等效性。
1 材料与方法
1.1 受试者的选择 受试者均为健康志愿者，年龄21～25岁，体重52～61kg。实验前经病史询问、体格检查和实验室检查未发现异常，受试前两周及实验期间未服用任何药物，实验期间禁烟、酒及含咖啡因的饮料。受试者均签署知情同意书。
1.2 试验设计 采用双制剂双周期随机交叉试验设计，将20名健康受试者随机分成两组，每组10人。一组首先服用试验制剂500mg，经两周洗脱后再服用参比制剂500mg;另一组按相反顺序等剂量服药。每次服药后2h内禁止饮水(包括饮料)，服药后4h统一清淡饮食，观察并记录服药后的不良事件，并作安全性评价。抽取服药前和服药后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0、72.0h血样5ml，分离血清于-20℃保存。
1.3 仪器及试药 Waters公司高液相色谱仪，包括1525泵，2487型紫外双波长检测器，Breeze数据处理系统等;TL-16台式高速冷冻离心机;涡旋混合器。试验制剂为海南海力制药有限公司研制的替硝唑片(批号040201，规格0.5g/片);参比制剂为湖北广济药业股份有限公司生产的替硝唑片(批号20031002，规格:0.5g/片);替硝唑对照品;其它试剂包括甲醇(色谱纯)、双蒸馏水等。
1.4 方法
1.4.1 HPLC色谱条件 流动相为甲醇:水(25:75);色谱柱为Kromasit C18，5u，4.6×150mm;柱温为室温;紫外检测波长为317nm，灵敏度为0.005AUFS;流动相流速为1.0ml/min;进样量为20μl。
1.4.2 血清样品的提取与分离 取血清样品0.1ml，加80%甲醇0.3ml涡旋30秒，5000rpm，离心6min。取上清液20μl进样，用峰高进行定量分析。
2 结果
2.1 HPCL方法特异性 取空白血浆，按1.4.2方法处理，所得色谱图表明，替硝唑与内源性杂质峰分离良好，见图1。
2.2 标准曲线 用空白血浆将浓度为240.79μg/L替硝唑标准储备液稀释制成浓度分别为0.188、0.376、0.752、1.505、3.010、6.020、12.040、24.079μg/ml的溶液，按1.4.2项下操作，记录峰高，用峰高对浓度进行回归，得回归方程:Y=718X-58.7，r=0.999，在0.188～24.079μg/ml范围内，线性关系良好，最低定量限为0.188μg/ml。
图1 替硝唑HPLC色谱图(略)
A:空白血浆色谱图;B:空白血浆加入替硝唑标准品色谱图;C:受试者口服替硝唑后0.25h血浆样品色谱图替硝唑保留时间为8min左右
2.3 准确度及精密度 采用高、中、低浓度(0.188、1.505、12.040μg/ml)，对本法分别进行准确度及精密度考察，得替硝唑准确度(相对回收率)结果见表1。精密度(日内变异和日间变异)结果见表2。结果表明本法相对回收率在85%～115%范围内，日内变异和日间变异的RSD<15%，符合生物样品分析方法要求。
表1 血清中替硝唑平均回收率(略)
表2 方法精密度测定结果(略)
2.4 健康志愿者口服参比制剂或试验制剂后主要药代动力学参数 见表3，平均血药浓度-时间曲线见图2。Tmax经Mann-Whitney检验，不同制剂间无显著性差异(Z=-0.2355，P=0.8201)。AUC 0→72 、C max 经对数转换后，进行方差分析，结果表明:两者在不同制剂间和不同周期间差异无显著性意义(P>0.05)。将C max 对数化后行双单侧t-检验，th及tl值分别为11.91和10.87，均大于单侧t 0.05 (1.686)。将AUC 0→72 对数化后行双单侧t-检验，th及tl值分别为53.96和53.70，均大于单侧t 0.05 (1.686)。试验制剂的相对生物利用度F为(100.14±9.46)%，其C max 的90%可信区间(11.58～12.89ng·h/ml)未超出参比制剂C max 70%～143%的范围(8.49～17.34ng·h/ml)。受试制剂AUC 0→72 的90%可信区间(246.95～259.72ng·h/ml)未超出参比制剂AUC 0→72 80%～125%的范围(206.29～322.33ng·h/ml)。
表3 单剂空腹口服替硝唑500mg后的药代动力学参数(略)
图2 受试者空腹口服受试制剂和参比制剂500mg后平均药-时曲线(略)
3 讨论
试验结果显示，健康受试者空服口服替硝唑500mg后，其药代动力学参数与文献报道相仿。经方差分析检验，参比制剂与试验制剂的药代动力学参数在两组间的差异均无统计学意义;对两药的C max ，AUC等参数以双向单侧t检验法和90%可信区间法进行了统计分析，均符合生物等效性判断标准，据此提示，试验制剂与参比制剂在人体内吸收速度和吸收量的差异无显著性意义，替硝唑试验制剂与参比具生物等效性。
参考文献:
[1]张君仁，臧恒昌.体内药物分析[M].北京:化学工业出版社，2002.
[2]中华人民共和国药典(二部)[S].2000年版., http://www.100md.com(林明琴，邝少轶，庄仁志)
关键词:替硝唑;生物等效性;高效液相色谱法
Experimental study on the bioequivalence of tinidazole tablet in human body.
LIN Ming-qin，KUANG Shao-yi，ZHUANG Ren-zhi.
(Hainan Medical College，Haikou571101，Hainan，P.R.China)
Abstract:Objective To observe the bioequivalence of tinidazole tablets in the healthy human body. Methods An open randomized cross-over study on the observation of single oral dose of500mg tinidazole tablets was carried out.The concentration of tinidazole in serum were determined by HPLC. Results The concentrations of C max 、T max 、T 1/2 、AUC 0→72 in the test group were(12.56±3.188)ng/ml，(2.01±1.24)ng/ml，(16.03±1.69)h and(257.55±47.46)ng/ml，while that in the control group were(12.13±2.23)ng/ml，(1.93±0.86)h，(15.79±1.88)h and(257.86±46.41)ng·h/ml，respectively.The pharmacokinetic pa-rameters of the two formulations were compared without showing significant difference(P>0.05). Conclusion The two tablets are bioequivalent.
Key words:Tinidazole;Bioequivalence;High performance liquid chromatography
替硝唑(Tinidazole，TND)化学名为2-甲基-1-[2-(乙基磺酰基)乙基]-5-硝基-1H-咪唑，与甲硝唑同属硝基咪唑类，是目前临床广范应用的强力抗厌氧菌及抗原虫感染性疾病治疗药。其口服吸收好，起效快，在体内广范分布，比甲硝唑血药浓度高，半衰期长，对各种常见的致病菌和滴虫的杀灭作用较甲硝唑强2～4倍，而毒副作用明显比甲硝唑低，特殊毒理研究表明，本品无致癌毒性。本文通过采用HPLC法测定健康志愿者血清中替硝唑的浓度，以评价海南海力制药有限公司研制的替硝唑片(受试制剂)与湖北广济药业股份有限公司生产替硝唑片(参比制剂)的生物等效性。
1 材料与方法
1.1 受试者的选择 受试者均为健康志愿者，年龄21～25岁，体重52～61kg。实验前经病史询问、体格检查和实验室检查未发现异常，受试前两周及实验期间未服用任何药物，实验期间禁烟、酒及含咖啡因的饮料。受试者均签署知情同意书。
1.2 试验设计 采用双制剂双周期随机交叉试验设计，将20名健康受试者随机分成两组，每组10人。一组首先服用试验制剂500mg，经两周洗脱后再服用参比制剂500mg;另一组按相反顺序等剂量服药。每次服药后2h内禁止饮水(包括饮料)，服药后4h统一清淡饮食，观察并记录服药后的不良事件，并作安全性评价。抽取服药前和服药后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0、72.0h血样5ml，分离血清于-20℃保存。
1.3 仪器及试药 Waters公司高液相色谱仪，包括1525泵，2487型紫外双波长检测器，Breeze数据处理系统等;TL-16台式高速冷冻离心机;涡旋混合器。试验制剂为海南海力制药有限公司研制的替硝唑片(批号040201，规格0.5g/片);参比制剂为湖北广济药业股份有限公司生产的替硝唑片(批号20031002，规格:0.5g/片);替硝唑对照品;其它试剂包括甲醇(色谱纯)、双蒸馏水等。
1.4 方法
1.4.1 HPLC色谱条件 流动相为甲醇:水(25:75);色谱柱为Kromasit C18，5u，4.6×150mm;柱温为室温;紫外检测波长为317nm，灵敏度为0.005AUFS;流动相流速为1.0ml/min;进样量为20μl。
1.4.2 血清样品的提取与分离 取血清样品0.1ml，加80%甲醇0.3ml涡旋30秒，5000rpm，离心6min。取上清液20μl进样，用峰高进行定量分析。
2 结果
2.1 HPCL方法特异性 取空白血浆，按1.4.2方法处理，所得色谱图表明，替硝唑与内源性杂质峰分离良好，见图1。
2.2 标准曲线 用空白血浆将浓度为240.79μg/L替硝唑标准储备液稀释制成浓度分别为0.188、0.376、0.752、1.505、3.010、6.020、12.040、24.079μg/ml的溶液，按1.4.2项下操作，记录峰高，用峰高对浓度进行回归，得回归方程:Y=718X-58.7，r=0.999，在0.188～24.079μg/ml范围内，线性关系良好，最低定量限为0.188μg/ml。
图1 替硝唑HPLC色谱图(略)
A:空白血浆色谱图;B:空白血浆加入替硝唑标准品色谱图;C:受试者口服替硝唑后0.25h血浆样品色谱图替硝唑保留时间为8min左右
2.3 准确度及精密度 采用高、中、低浓度(0.188、1.505、12.040μg/ml)，对本法分别进行准确度及精密度考察，得替硝唑准确度(相对回收率)结果见表1。精密度(日内变异和日间变异)结果见表2。结果表明本法相对回收率在85%～115%范围内，日内变异和日间变异的RSD<15%，符合生物样品分析方法要求。
表1 血清中替硝唑平均回收率(略)
表2 方法精密度测定结果(略)
2.4 健康志愿者口服参比制剂或试验制剂后主要药代动力学参数 见表3，平均血药浓度-时间曲线见图2。Tmax经Mann-Whitney检验，不同制剂间无显著性差异(Z=-0.2355，P=0.8201)。AUC 0→72 、C max 经对数转换后，进行方差分析，结果表明:两者在不同制剂间和不同周期间差异无显著性意义(P>0.05)。将C max 对数化后行双单侧t-检验，th及tl值分别为11.91和10.87，均大于单侧t 0.05 (1.686)。将AUC 0→72 对数化后行双单侧t-检验，th及tl值分别为53.96和53.70，均大于单侧t 0.05 (1.686)。试验制剂的相对生物利用度F为(100.14±9.46)%，其C max 的90%可信区间(11.58～12.89ng·h/ml)未超出参比制剂C max 70%～143%的范围(8.49～17.34ng·h/ml)。受试制剂AUC 0→72 的90%可信区间(246.95～259.72ng·h/ml)未超出参比制剂AUC 0→72 80%～125%的范围(206.29～322.33ng·h/ml)。
表3 单剂空腹口服替硝唑500mg后的药代动力学参数(略)
图2 受试者空腹口服受试制剂和参比制剂500mg后平均药-时曲线(略)
3 讨论
试验结果显示，健康受试者空服口服替硝唑500mg后，其药代动力学参数与文献报道相仿。经方差分析检验，参比制剂与试验制剂的药代动力学参数在两组间的差异均无统计学意义;对两药的C max ，AUC等参数以双向单侧t检验法和90%可信区间法进行了统计分析，均符合生物等效性判断标准，据此提示，试验制剂与参比制剂在人体内吸收速度和吸收量的差异无显著性意义，替硝唑试验制剂与参比具生物等效性。
参考文献:
[1]张君仁，臧恒昌.体内药物分析[M].北京:化学工业出版社，2002.
[2]中华人民共和国药典(二部)[S].2000年版., http://www.100md.com(林明琴，邝少轶，庄仁志)