关键词 顺铂；肿瘤坏死因子；湿热效应；骨肉瘤

    高温隔离灌注化疗作为骨肉瘤新辅助化疗的一部分，在控制肿瘤原发灶、提高保肢成功率等方面已取得了肯定的效果，但仍有40%左右的骨肉瘤患者在治疗后1年内复发或转移[1]。增强骨肉瘤的化疗效果，提高骨肉瘤患者的无瘤生存率是目前亟待解决的问题。

    肿瘤坏死因子(TNF-α)是新近发现具有肿瘤热化疗增效作用的药物，已有在骨肉瘤治疗中应用的报道，但有关的实验研究甚少[2]。本研究拟观察TNF-α结合顺铂热化疗对人骨肉瘤细胞OS-732的作用，探讨其协同作用机制，为临床应用提供实验依据。

     1 材料与方法

    1.1 骨肉瘤细胞系 人类骨肉瘤细胞系OS-732 购自协和细胞库；传代培养条件为37℃，5%CO2和95%相对湿度；培养基为RPMI 1640，添加10%胎牛血清和100μg/ml青霉素和链霉素。

    1.2 化疗药物 顺铂(DDP)购自齐鲁制药厂，人肿瘤坏死因子(TNF-α)为上海赛达生物药业有限公司产品。药物储存液根据说明书进行配制、储存于-20℃冰箱。

    1.3 试剂和耗材 RPMI 1640 和胎牛血清为Hyclone 公司产品；MTT、二甲亚砜(DMSO)、碘丙碇(PI)、结晶紫和RNA酶均为Sigma公司产品；Caspase-3荧光生色底物DEVD-AMC购于Calbiochem公司，transwell小室和96孔培养板为Costar产品,matrigel和纤粘连蛋白分别为Becton Dichinson 和Promega公司产品。

    1.4 温热效应研究 对数生长期OS-732细胞经胰酶消化后，计数后调整浓度，以每孔接种量为2.5×103/ml和2×104/ml，分别接种于96孔和24孔培养板中培养过夜，每个处理组3个平行孔。根据细胞株与不同药物的作用过程分成五组：①单纯温热处理1h。②在37℃和43℃用浓度为50μg/ml DDP作用1h。③在37℃用浓度为100U/ml的TNF-α作用24h。④先用浓度为100U/ml的TNF-α处理24h，然后用50μg/ml DDP于37℃和43℃分别处理1h。各组处理完后，小心吸出培养液，然后加入新鲜培养液200μl ......