脂氧合酶抑制剂NDGA对HT29结肠癌细胞诱导凋亡机制研究
【摘要】目的：探讨脂氧合酶抑制剂NDGA体外诱导HT29结肠癌细胞凋亡机制。方法：RTPCR检测NDGA处理后HT29结肠癌细胞5脂氧合酶信使核糖核酸(5LOXmRNA)和端粒酶催化活性亚单位(hTERTmRNA)表达水平变化，激光共焦显微镜观察细胞内游离钙变化。结果：结肠癌HT29细胞5LOXmRNA和hTERTmRNA呈阳性表达，随着NDGA药物浓度的增大，细胞凋亡率的上升，5LOXmRNA和hTERTmRNA表达水平逐步下降。细胞内钙浓度同步上升。结论：NDGA诱导凋亡是多方面因素共同作用的结果，5LOX、端粒酶、游离钙都可能参与其诱导凋亡的过程。
【关键词】脂氧合酶抑制剂·细胞凋亡·5脂氧合酶·端粒，末端转移酶·钙·结肠肿瘤
Research on apoptosis mechanism of HT29 colon cancer cell induced by NDGA
XIA Guangtao1,ZHANG Yuanchao1,WU Sensen2,YIN Lixia3,ZHANG Shangzhong2
1Department of Rheumatism,Shandong Provincial Hospital of Shandong University
(Jinan 250021,China)
2Department of Digestion,Qilu Hospital of Shandong University(Jinan 250021,China)
3Department of Paediatrics,People’s Hospital of Chiping County(Shandong 252100,
China)
【ABSTRACT】Objective:To find out the apoptosis mechanism of HT29 colon cancer cell induced by NDGA,the lipoxygenase inhibitor in vitro.Methods:We applied respectively:RTPCR to detect colon cancer cell’s expression of 5LOX messenger ribonucleic acid(5LOXmRNA) and that of messenger ribonucleic acid about human telomerase reverse transcriptase(hTERTmRNA)respectively,confocal laser scanning electron microscope to examine intracellular free calcium.Results:Colon cancer cell lines HT29 showed positive expression of 5LOXmRNA.This expression became weaker following the rise of cell’s apoptosis and so were hTERTmRNA.Intracellular Free calcium increased following the rise of cell’s apoptosis.Conclusion:The apoptosis of tumor cell is caused by a combination of factors,with 5LOX,telomerase and free calcium all active in the course.
【KEY WORDS】Lipoxygenase inhibitors·Apoptosis·5Lipoxygenase·Telomerase·Calcium·Colonic neoplasms 花生四烯酸代谢分为环氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两个途径，这两个途径与肿瘤细胞凋亡的关系比较密切。研究证明脂氧合酶抑制剂去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid，NDGA)能够诱导HT29结肠癌细胞发生凋亡[1]，本文从5LOX、端粒酶(hTERT)、游离钙三个方面研究其诱导凋亡的机制。
1 材料与方法
1.1 仪器及设备 37℃ CO2恒温培养箱(NV2500E，美国)，超净工作台(YJ1450S，苏州)，倒置相差显微镜(Olympus,日本)普通光学显微镜(Olympus,日本BH2)，台式高速离心机(HERMLEZK380)，稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)，PCR扩增仪(MiniCycler公司)，激光共聚焦扫描显微镜(LSM510，德国ZEISS公司)，图像处理软件ImagePro plus(Zeiss LSM Version3,1,0,99)以及其他常规细胞培养设备。
1.2 材料和试剂
1.2.1 结肠癌细胞株 HT29结肠癌细胞株购自山东省医学科学院肿瘤生物治疗中心。
1.2.2 主要试剂 RPMI1640培养液和胰蛋白酶购自Gibco公司。新生小牛血清购自中国杭州四季青生物工程材料研究所。NDGA购自Calbiochem公司，RTPCR试剂盒购自济南贝西生物公司。Fluo3/AM购自美国Molecular Probe公司，用DMSO将其溶解后配成1mmol/L的储存液，-20℃避光保存，实验时用无钙PBS稀释成5μmol/L。
1.3 细胞培养 常规培养HT29结肠癌细胞。采用处于指数生长期的细胞进行实验，分别加入不同浓度的药物药处理后，继续在CO2恒温箱孵育相应的时间后，进行有关指标检测。
1.4 RTPCR检测5LOXmRNA
引物序列：
上游引物：5’CCCGGGGCATGGAGAGCA3’
下游引物：5’GCGGTCGGGCAGCGTGTC3’
扩增片断长度为416bp。
βaction作为内参照物
上游引物：P1 5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’
下游引物：P2 5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’
扩增片断长度为539bp。所有引物由上海博亚生物公司合成。
分别将对照组及不同浓度药物(1，10，100μmol/L)处理48h后的癌细胞应用胰蛋白酶消化、培养液中和后离心(1000r/min,5min)，PBS液冲洗后再离心1次，将细胞收入无菌EP管中保存于-80℃冰箱中保存备用。先提取总DNA，再逆转录成cDNA，进行PCR反应。PCR循环条件：94℃1min，58℃1min，72℃1min，循环35次，末次延长7min，2%琼脂凝胶电泳鉴定。紫外线灯下观察、照相。凝胶电泳图像输入美国Kogak凝胶分析系统，应用1D Image Analysis Softare进行表达强度分析，测出5LOX表达强度，计算相对指数，根据相对指数作统计学分析。相对指数=5LOX表达强度/βaction表达强度
1.5 RTPCR检测hTERTmRNA
引物设计：
上游引物：5’TTCCTGCACTGGCTGATGAGTGT3’
下游引物：5’CGCTCGGCCCTCTTTCTCTG3’
扩增片断长度为329bp。
βaction作为内参照物
上游引物：P1 5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’
下游引物：P2 5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’
扩增片断长度为539bp。所有引物由上海博亚生物公司合成。
实验方法同上。
1.6 激光扫描共聚焦显微镜测细胞内游离钙 将对照组及NDGA作用组细胞用无钙PBS清洗2~3次，加入200μL Fluo3/AM染液避光染色30min，用适量无钙PBS冲洗2遍，留少许通过共聚焦激光扫描显微镜以488nm氩离子激光激发后观察细胞内Ca2+的变化，并记录该视野的荧光强度，以细胞的荧光强度反映Ca2+的浓度。 细胞荧光强度=(该视野荧光强度/该视野细胞数)×系数
1.7 统计学处理 定量资料数据均以x±s表示，计算采用SPSS12.0统计软件处理，进行方差分析、t检验、Dunnett t检验以及其他统计处理，P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 NDGA对HT29结肠癌细胞5LOXmRNA表达的影响 RTPCR检测癌细胞5LOXmRNA的表达，βactin条带表现为扩增片断长度为539bp，宽窄及深浅基本一致，而5LOXmRNA条带表现为扩增片断长度为416bp，随着药物浓度增高，条带逐步变窄，变暗。提示的5LOXmRNA表达逐步降低。根据5LOXmRNA和βactin的表达强度计算相对指数，经1，10，100μmol/L浓度的NDGA作用后HT29结肠癌细胞其相对指数分别与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1，图1。表1 不同浓度NDAG对HT29细胞5LOXmRNA表达影响(相对指数0[]0.728±0.0371[]0.547±0.066*10[]0.199±0.030*100[]0.095±0.009* *P<0.01 VS 0μmol/L组(对照组)2.2 NDGA对HT29结肠癌细胞hTERTmRNA的影响 βactin条带表现为扩增长度为539bp，宽窄及深浅基本一致，而hTERTmRNA条带表现为扩增片断长度为329bp，随着药物浓度增高，条带逐步变窄，变暗，提示hTERTmRNA表达逐步降低。根据hTERTmRNA和βactin的表达强度计算相对指数，经1，10，100μmol/L浓度的NDGA作用后HT29结肠癌细胞其相对指数，分别与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2，图2。 图1 NDGA对HT29结肠癌细胞5LOXmRNA表达影响RTPCR表2 不同浓度NDGA对HT29细胞hTERTmRNA表达影响( 图2 NDGA对HT29癌细胞hTERTmRNA表达影响(RTPCR)
2.3 激光共聚焦显微镜测细胞内游离钙 以细胞的荧光强度表示细胞内游离钙，经1，10，100μmol/L浓度NDGA分别处理后其细胞内荧光强度逐步升高。10，100μmol/L的NDGA处理后细胞内荧光强度与对照组差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表3，图3。
3 讨 论
细胞凋亡是一个多因素共同参与的过程。LOX又分为表3 不同浓度NDGA对结肠癌HT29细胞内游离钙影响 图3 NDGA作用后细胞内游离钙的变化(×200) A：0μmol/L B:100μmol/L3个亚型，5LOX、12LOX、15LOX，其中5LOX是比较重要的一个亚型，在肿瘤的发生方面起重要作用。大多数肿瘤细胞表达此物质[2]。研究认为，其作用机制主要是5LOX在钙的刺激下由细胞质转到核膜上，5脂氧合酶激活蛋白(FALP)与细胞膜磷脂释放出来的花生四稀酸(AA)特异性结合，将后者呈递给5LOX。5LOX影响AA氧化生成白三烯A4(LTA4)。继而影响LTA4转化为致炎物白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD4)、白三烯E4(LTE4)等导致过敏反应的慢反应物质的生成[3]。Matsuyama M等[4]研究发现，应用5LOX抑制剂处理肾癌细胞，能够抑制剂癌细胞的生长，并且这种作用具有剂量依赖性。Hoque等[5]研究发现在79%食管癌患者的组织中表达5LOX，应用5LOX抑制剂AA861和REV5901能够诱导食管癌细胞发生凋亡，抑制细胞活力，同样具有剂量依赖性。在肺癌、前列腺癌等其他肿瘤也出现相似结果[6]。本实验应用RTPCR检测HT29结肠癌细胞5LOX呈阳性表达，随着NDGA药物作用浓度加大，5LOX表达逐步减弱，表明NDGA能够抑制5LOX表达，从而影响LT等产物的合成，影响细胞内代谢，从而诱发肿瘤细胞发生凋亡，与文献观点基本一致。
肿瘤凋亡机制，有关端粒酶的研究发现85%肿瘤组织中端粒酶检测阳性，而在90%以上的正常组织中端粒酶检测阴性，从而将端粒酶与肿瘤密切联系在一起。研究证实，端粒功能如被激活，细胞可获得无限增值的能力，导致肿瘤的发生[7]。抑制端粒酶活性，可以抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。有学者应用药物降低端粒酶表达，诱导肺癌细胞凋亡，使其生长抑制[8]。端粒酶有3个主要成分：端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白、端粒酶活性催化亚单位(hTERT)。其中，hTERT是端粒酶活性的限速因子，与端粒酶的活性成正相关，能够反映出端粒酶的活性。本实验发现NDGA抑制肿瘤细胞生长的同时，影响hTERTmRNA表达，提示端粒酶活性降低，证明NDGA抑制端粒酶活性是其作用于HT29结肠癌细胞机制之一。
正常细胞内游离钙浓度([Ca2+]I)为50~150nmol/L，与细胞外钙离子浓度相差近10000倍，极少量的游离钙对细胞功能的调节起着极其重要的作用。国内大部分研究认为，Ca2+在信号传导中起着重要作用，是各条信号途径的枢纽。病理状态下细胞内钙超载将造成一紊列代谢系乱，直至细胞坏死或凋亡。应用激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内游离钙。Fluo3/AM是新一代荧光探针，是一种脂溶性钙荧光指示剂，可穿过细胞膜进入细胞内，与细胞内的游离钙相结合，细胞内荧光强度的强弱代表细胞内游离钙浓度的高低。本实验显示，随着药物浓度升高，凋亡率的上升，细胞内游离钙荧光强度增强，表示细胞内游离钙的浓度逐步上升，提示细胞内游离钙的变化参与结肠癌HT29细胞的凋亡过程。但其具体影响机制还有待于进一步研究。
参 考 文 献
[1]夏光涛，张源潮，武森森，等.脂氧合酶抑制剂NDGA对HT29结肠癌细胞诱导凋亡的研究[J].中国现代普通外科进展，2006，9(1).
[2]Sung H Hong,Ingalill Avis,Michele D,et al.Relationship of arachidonic acid metabolizing enzyme expression in epithelial cancer cell lines to the growth effect of selective biochemical inhibitors[J].Cancer Res，1999,59(1):22232228.
[3]权华，殷明.5脂氧合酶代谢通路与肿瘤细胞增值及凋亡的关系[J].国外医学肿瘤学分册，2003，30(1)：5760.
[4]Matsuyama M,Yoshimura R,Mitsuhashi M,et al.5Lipoxygenase inhibitors attenuate growth of human renal cell carcinoma and induce apoptosis through arachidonic acid pathway[J].Oncol Rep,2005,14(1):7379.
[5]Hoque A,Lippman SM,Wu TT,et al.Increased 5lipoxygenase expression and induction of apoptosis by its inhibitors in esophageal cancer:a potential target for prevention[J].Carcinogenesis,2005,26(4):785791.
[6]Vernon E,Steele,Cathy,A,et al.Lipoxygenase inhibitors as potential cancer chemopreventives[J].Cancer Epidemiol Biomar Prev,1999,5(8):467483.
[7]曹红云.端粒及端粒酶研究现状[J].龙岩师专学报，2004，22(3)：6768.
[8]Woo HJ,Choi,YH.Growth inhibition of A549 human lung carcinoma cells by betalapachone through induction of apoptosis and inhibition of telomerase activity[J].Int J Oncol,2005,26(4):10171023.
[9]刘华，马春红，刘素侠，等.两种端粒酶逆转录酶启动子真核表达载体的构建[J].中国现代普通外科进展，2005，8(4)：212215.
1山东大学山东省立医院 风湿免疫科 (山东 济南 250021)
2山东大学齐鲁医院 消化科 (山东 济南 250012)
3山东省茌平县人民医院 儿科 (山东 茌平 252100), http://www.100md.com(夏光涛 张源潮 武森森 阴丽霞 张尚忠)
【关键词】脂氧合酶抑制剂·细胞凋亡·5脂氧合酶·端粒，末端转移酶·钙·结肠肿瘤
Research on apoptosis mechanism of HT29 colon cancer cell induced by NDGA
XIA Guangtao1,ZHANG Yuanchao1,WU Sensen2,YIN Lixia3,ZHANG Shangzhong2
1Department of Rheumatism,Shandong Provincial Hospital of Shandong University
(Jinan 250021,China)
2Department of Digestion,Qilu Hospital of Shandong University(Jinan 250021,China)
3Department of Paediatrics,People’s Hospital of Chiping County(Shandong 252100,
China)
【ABSTRACT】Objective:To find out the apoptosis mechanism of HT29 colon cancer cell induced by NDGA,the lipoxygenase inhibitor in vitro.Methods:We applied respectively:RTPCR to detect colon cancer cell’s expression of 5LOX messenger ribonucleic acid(5LOXmRNA) and that of messenger ribonucleic acid about human telomerase reverse transcriptase(hTERTmRNA)respectively,confocal laser scanning electron microscope to examine intracellular free calcium.Results:Colon cancer cell lines HT29 showed positive expression of 5LOXmRNA.This expression became weaker following the rise of cell’s apoptosis and so were hTERTmRNA.Intracellular Free calcium increased following the rise of cell’s apoptosis.Conclusion:The apoptosis of tumor cell is caused by a combination of factors,with 5LOX,telomerase and free calcium all active in the course.
【KEY WORDS】Lipoxygenase inhibitors·Apoptosis·5Lipoxygenase·Telomerase·Calcium·Colonic neoplasms 花生四烯酸代谢分为环氧化酶(COX)和脂氧合酶(LOX)两个途径，这两个途径与肿瘤细胞凋亡的关系比较密切。研究证明脂氧合酶抑制剂去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid，NDGA)能够诱导HT29结肠癌细胞发生凋亡[1]，本文从5LOX、端粒酶(hTERT)、游离钙三个方面研究其诱导凋亡的机制。
1 材料与方法
1.1 仪器及设备 37℃ CO2恒温培养箱(NV2500E，美国)，超净工作台(YJ1450S，苏州)，倒置相差显微镜(Olympus,日本)普通光学显微镜(Olympus,日本BH2)，台式高速离心机(HERMLEZK380)，稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)，PCR扩增仪(MiniCycler公司)，激光共聚焦扫描显微镜(LSM510，德国ZEISS公司)，图像处理软件ImagePro plus(Zeiss LSM Version3,1,0,99)以及其他常规细胞培养设备。
1.2 材料和试剂
1.2.1 结肠癌细胞株 HT29结肠癌细胞株购自山东省医学科学院肿瘤生物治疗中心。
1.2.2 主要试剂 RPMI1640培养液和胰蛋白酶购自Gibco公司。新生小牛血清购自中国杭州四季青生物工程材料研究所。NDGA购自Calbiochem公司，RTPCR试剂盒购自济南贝西生物公司。Fluo3/AM购自美国Molecular Probe公司，用DMSO将其溶解后配成1mmol/L的储存液，-20℃避光保存，实验时用无钙PBS稀释成5μmol/L。
1.3 细胞培养 常规培养HT29结肠癌细胞。采用处于指数生长期的细胞进行实验，分别加入不同浓度的药物药处理后，继续在CO2恒温箱孵育相应的时间后，进行有关指标检测。
1.4 RTPCR检测5LOXmRNA
引物序列：
上游引物：5’CCCGGGGCATGGAGAGCA3’
下游引物：5’GCGGTCGGGCAGCGTGTC3’
扩增片断长度为416bp。
βaction作为内参照物
上游引物：P1 5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’
下游引物：P2 5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’
扩增片断长度为539bp。所有引物由上海博亚生物公司合成。
分别将对照组及不同浓度药物(1，10，100μmol/L)处理48h后的癌细胞应用胰蛋白酶消化、培养液中和后离心(1000r/min,5min)，PBS液冲洗后再离心1次，将细胞收入无菌EP管中保存于-80℃冰箱中保存备用。先提取总DNA，再逆转录成cDNA，进行PCR反应。PCR循环条件：94℃1min，58℃1min，72℃1min，循环35次，末次延长7min，2%琼脂凝胶电泳鉴定。紫外线灯下观察、照相。凝胶电泳图像输入美国Kogak凝胶分析系统，应用1D Image Analysis Softare进行表达强度分析，测出5LOX表达强度，计算相对指数，根据相对指数作统计学分析。相对指数=5LOX表达强度/βaction表达强度
1.5 RTPCR检测hTERTmRNA
引物设计：
上游引物：5’TTCCTGCACTGGCTGATGAGTGT3’
下游引物：5’CGCTCGGCCCTCTTTCTCTG3’
扩增片断长度为329bp。
βaction作为内参照物
上游引物：P1 5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’
下游引物：P2 5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’
扩增片断长度为539bp。所有引物由上海博亚生物公司合成。
实验方法同上。
1.6 激光扫描共聚焦显微镜测细胞内游离钙 将对照组及NDGA作用组细胞用无钙PBS清洗2~3次，加入200μL Fluo3/AM染液避光染色30min，用适量无钙PBS冲洗2遍，留少许通过共聚焦激光扫描显微镜以488nm氩离子激光激发后观察细胞内Ca2+的变化，并记录该视野的荧光强度，以细胞的荧光强度反映Ca2+的浓度。 细胞荧光强度=(该视野荧光强度/该视野细胞数)×系数
1.7 统计学处理 定量资料数据均以x±s表示，计算采用SPSS12.0统计软件处理，进行方差分析、t检验、Dunnett t检验以及其他统计处理，P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 NDGA对HT29结肠癌细胞5LOXmRNA表达的影响 RTPCR检测癌细胞5LOXmRNA的表达，βactin条带表现为扩增片断长度为539bp，宽窄及深浅基本一致，而5LOXmRNA条带表现为扩增片断长度为416bp，随着药物浓度增高，条带逐步变窄，变暗。提示的5LOXmRNA表达逐步降低。根据5LOXmRNA和βactin的表达强度计算相对指数，经1，10，100μmol/L浓度的NDGA作用后HT29结肠癌细胞其相对指数分别与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1，图1。表1 不同浓度NDAG对HT29细胞5LOXmRNA表达影响(相对指数0[]0.728±0.0371[]0.547±0.066*10[]0.199±0.030*100[]0.095±0.009* *P<0.01 VS 0μmol/L组(对照组)2.2 NDGA对HT29结肠癌细胞hTERTmRNA的影响 βactin条带表现为扩增长度为539bp，宽窄及深浅基本一致，而hTERTmRNA条带表现为扩增片断长度为329bp，随着药物浓度增高，条带逐步变窄，变暗，提示hTERTmRNA表达逐步降低。根据hTERTmRNA和βactin的表达强度计算相对指数，经1，10，100μmol/L浓度的NDGA作用后HT29结肠癌细胞其相对指数，分别与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2，图2。 图1 NDGA对HT29结肠癌细胞5LOXmRNA表达影响RTPCR表2 不同浓度NDGA对HT29细胞hTERTmRNA表达影响( 图2 NDGA对HT29癌细胞hTERTmRNA表达影响(RTPCR)
2.3 激光共聚焦显微镜测细胞内游离钙 以细胞的荧光强度表示细胞内游离钙，经1，10，100μmol/L浓度NDGA分别处理后其细胞内荧光强度逐步升高。10，100μmol/L的NDGA处理后细胞内荧光强度与对照组差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表3，图3。
3 讨 论
细胞凋亡是一个多因素共同参与的过程。LOX又分为表3 不同浓度NDGA对结肠癌HT29细胞内游离钙影响 图3 NDGA作用后细胞内游离钙的变化(×200) A：0μmol/L B:100μmol/L3个亚型，5LOX、12LOX、15LOX，其中5LOX是比较重要的一个亚型，在肿瘤的发生方面起重要作用。大多数肿瘤细胞表达此物质[2]。研究认为，其作用机制主要是5LOX在钙的刺激下由细胞质转到核膜上，5脂氧合酶激活蛋白(FALP)与细胞膜磷脂释放出来的花生四稀酸(AA)特异性结合，将后者呈递给5LOX。5LOX影响AA氧化生成白三烯A4(LTA4)。继而影响LTA4转化为致炎物白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD4)、白三烯E4(LTE4)等导致过敏反应的慢反应物质的生成[3]。Matsuyama M等[4]研究发现，应用5LOX抑制剂处理肾癌细胞，能够抑制剂癌细胞的生长，并且这种作用具有剂量依赖性。Hoque等[5]研究发现在79%食管癌患者的组织中表达5LOX，应用5LOX抑制剂AA861和REV5901能够诱导食管癌细胞发生凋亡，抑制细胞活力，同样具有剂量依赖性。在肺癌、前列腺癌等其他肿瘤也出现相似结果[6]。本实验应用RTPCR检测HT29结肠癌细胞5LOX呈阳性表达，随着NDGA药物作用浓度加大，5LOX表达逐步减弱，表明NDGA能够抑制5LOX表达，从而影响LT等产物的合成，影响细胞内代谢，从而诱发肿瘤细胞发生凋亡，与文献观点基本一致。
肿瘤凋亡机制，有关端粒酶的研究发现85%肿瘤组织中端粒酶检测阳性，而在90%以上的正常组织中端粒酶检测阴性，从而将端粒酶与肿瘤密切联系在一起。研究证实，端粒功能如被激活，细胞可获得无限增值的能力，导致肿瘤的发生[7]。抑制端粒酶活性，可以抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。有学者应用药物降低端粒酶表达，诱导肺癌细胞凋亡，使其生长抑制[8]。端粒酶有3个主要成分：端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白、端粒酶活性催化亚单位(hTERT)。其中，hTERT是端粒酶活性的限速因子，与端粒酶的活性成正相关，能够反映出端粒酶的活性。本实验发现NDGA抑制肿瘤细胞生长的同时，影响hTERTmRNA表达，提示端粒酶活性降低，证明NDGA抑制端粒酶活性是其作用于HT29结肠癌细胞机制之一。
正常细胞内游离钙浓度([Ca2+]I)为50~150nmol/L，与细胞外钙离子浓度相差近10000倍，极少量的游离钙对细胞功能的调节起着极其重要的作用。国内大部分研究认为，Ca2+在信号传导中起着重要作用，是各条信号途径的枢纽。病理状态下细胞内钙超载将造成一紊列代谢系乱，直至细胞坏死或凋亡。应用激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内游离钙。Fluo3/AM是新一代荧光探针，是一种脂溶性钙荧光指示剂，可穿过细胞膜进入细胞内，与细胞内的游离钙相结合，细胞内荧光强度的强弱代表细胞内游离钙浓度的高低。本实验显示，随着药物浓度升高，凋亡率的上升，细胞内游离钙荧光强度增强，表示细胞内游离钙的浓度逐步上升，提示细胞内游离钙的变化参与结肠癌HT29细胞的凋亡过程。但其具体影响机制还有待于进一步研究。
参 考 文 献
[1]夏光涛，张源潮，武森森，等.脂氧合酶抑制剂NDGA对HT29结肠癌细胞诱导凋亡的研究[J].中国现代普通外科进展，2006，9(1).
[2]Sung H Hong,Ingalill Avis,Michele D,et al.Relationship of arachidonic acid metabolizing enzyme expression in epithelial cancer cell lines to the growth effect of selective biochemical inhibitors[J].Cancer Res，1999,59(1):22232228.
[3]权华，殷明.5脂氧合酶代谢通路与肿瘤细胞增值及凋亡的关系[J].国外医学肿瘤学分册，2003，30(1)：5760.
[4]Matsuyama M,Yoshimura R,Mitsuhashi M,et al.5Lipoxygenase inhibitors attenuate growth of human renal cell carcinoma and induce apoptosis through arachidonic acid pathway[J].Oncol Rep,2005,14(1):7379.
[5]Hoque A,Lippman SM,Wu TT,et al.Increased 5lipoxygenase expression and induction of apoptosis by its inhibitors in esophageal cancer:a potential target for prevention[J].Carcinogenesis,2005,26(4):785791.
[6]Vernon E,Steele,Cathy,A,et al.Lipoxygenase inhibitors as potential cancer chemopreventives[J].Cancer Epidemiol Biomar Prev,1999,5(8):467483.
[7]曹红云.端粒及端粒酶研究现状[J].龙岩师专学报，2004，22(3)：6768.
[8]Woo HJ,Choi,YH.Growth inhibition of A549 human lung carcinoma cells by betalapachone through induction of apoptosis and inhibition of telomerase activity[J].Int J Oncol,2005,26(4):10171023.
[9]刘华，马春红，刘素侠，等.两种端粒酶逆转录酶启动子真核表达载体的构建[J].中国现代普通外科进展，2005，8(4)：212215.
1山东大学山东省立医院 风湿免疫科 (山东 济南 250021)
2山东大学齐鲁医院 消化科 (山东 济南 250012)
3山东省茌平县人民医院 儿科 (山东 茌平 252100), http://www.100md.com(夏光涛 张源潮 武森森 阴丽霞 张尚忠)