大鼠门脉高压症脾次全切除术对部分免疫功能的影响
【摘要】目的：通过门脉高压症(PHT)脾次全切除术后细胞免疫和体液免疫的变化，初步评价脾次全切除术在门脉高压症中的作用。方法：建立肝硬化PHT大鼠疾病模型。实验分5组，每组10只。正常对照组(NCG)，实验对照组(ECG)，全脾切除组(TSG)，保留正常脾脏50%的脾部分切除组(R50%NSG)，保留正常脾脏大小的脾部分切除组(RNSG)。术后4周对各组进行血常规、免疫球蛋白、T淋巴细胞亚群的测定及病理学检查。结果：术后4周R50%NSG组与RNSG组与NCG组和ECG组血常规、免疫球蛋白和T淋巴细胞亚群水平差异无统计学意义。ECG光镜下见假小叶，再生的肝细胞结节肝细胞索排列紊乱等肝硬化表现脾包膜增厚，脾实质充血严重。脾内纤维严重增生。R50%NSG和RNSG光镜下见肝纤维化程度减轻，脾包膜变薄，脾实质轻度充血。结论：PHT残余脾脏具有一定的生理功能；保留部分脾脏的脾部分切除术在一定程度上能够维持机体的体液免疫和细胞免疫。
【关键词】脾次全切除术·门静脉高压症，门静脉·免疫功能
The influence of subtotal splenectomy on partial immunlogical function in rats with poroal hypertension
LIU Chengwei1,ZHANG Xuesong2,WANG Shuqing2,LUO Wei2，ZHANG Qiang1
1Department of Third General Surgery,the First Affiliated Hospital,China Medical University (Shenyang 110001,China)
2Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital,Jiamusi University(Jiamusi 154003,China)
【ABSTRACT】Objective:To detect the change of cell immunity and body fluid immunity after subtotal splenectomy in portal hypertension of rat ,and preliminarily evaluate the role of subtotal splenectomy in portal hypertension.Methods:We established the rat model of hepatic cirrhosis portal hypertension.Rats were divided to five groups:normal control group(NCG);experimental control group(ECG),total splenectomy group(TSG),retain fifty percent size of normal spleen group(R50%NSG),retain the same size of normal spleen group(RNSG).Measured the Blood routine,Immunoglobulin,T Iymphocyte subgroup and stained with hematoxylin and eosin (HE) at 4 weeks after surgery.Results:There were not significant different between RNSG and NCG in Blood routine,Immunoglobulin,T Iymphocyte subgroup at 4 weeks after operation.ECGcould be seen by light microscope that the tissue of normal hepatic lobule was destructed,and appeared pseudolobule.Disarrangement of regenerated hepatic cell nodus and liver cell cord,fatty degeneration in hepatic cell,thickening of spleen capsule and serious congestion of spleen parenchyma,atrophy of white pulp and shrinking of follicle and germinal center R50%NSG and RNSG could be seen that hepatic fibrosis,spleen capsule thichening and congesition of splenic parenchyma to a less extent.Conclusion:Remaining spleen of portal hypertension caused by hepatic cirrhosis has physiology functions.In some degree,splenectomy of retaining the same size of normal spleen could maintain body fluid immunity and cell immunity of organism.
【KEY WORDS】Subtotal splenectomy·Portal hypertension·Immunological function
门脉高压症(portal hypertension,PHT)表现有脾大和脾功能亢进，食管胃底静脉曲张和呕血、腹水等症状。脾脏切除是其治疗方法之一，但对于脾脏的“切”和“保”尚存在分岐。本文研究门脉高压症脾次全切除术后实际免疫功能的变化，以期为临床治疗提供参数。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备与分组 健康雄性Wistar大鼠100只，体重200～250g。建立PHT大鼠模型：大鼠腹部皮下注射60%CCl4(0.3ml/100g)油溶液，首次剂量加倍(0.5ml/100g)，每4日1次，共15次，同时10%乙醇溶液代替饮水，60d后随机抽样10只，测量门静脉压≥12mmHg(腹腔注射麻醉后，打开腹腔暴露门脉主干，于肠系膜前静脉右侧靠近门脉处分离出一回肠肠系膜静脉分支，结扎其远端，然后用血管剪剪开一适宜缺口，将PE100导管自缺口插入后，沿肠系膜前静脉上行，通过脾静脉至门脉主干，固定导管并接通压力换能器测量门静脉压力)及病理证实大鼠肝硬化PHT模型成功(建模过程中死亡35只)。实验共分5组(10只/组)：①正常对照组(NCG)：自由饮食的正常大鼠，10%水合氯醛水溶液300mg/kg腹腔注射麻醉后，剖腹切除部分大网膜；②实验对照组(ECG)：PHT大鼠，麻醉后剖腹切除部分大网膜；③全脾切除组(TSG)：PHT大鼠，麻醉后剖腹，1号丝线双重结扎脾门血管，行全脾切除，如有副脾一并切除；④R50%NSG组PHT大鼠，麻醉后剖腹，切除脾上极大部分，保留脾下极组织体积约为正常脾脏的50%；⑤RNSG组：PHT大鼠，麻醉后剖腹，切除脾上极大部分，保留脾下极组织体积约为正常脾脏大小。
1.2 指标与测定方法
1.2.1 血常规的测定 各组术后2、3、4周经大鼠内眦静脉用细玻璃管采血，每次1ml置于含肝素的抗凝管中，利用Sysmex kx21仪器，电阻法(测血球计数)和比色法(测血红蛋白)测定。
1.2.2 免疫球蛋白的测定 术后4周，取待测血清0.1ml，加生理盐水0.3ml混匀，测IgG、 IgA各取10μl，测IgM取20μl，分别注入G、A、M板孔中，放入37℃培养箱内，48h后观察结果，测沉淀直径与对应标准曲线中查出免疫球蛋白的含量。
1.2.3 T淋巴细胞亚群测定 待测血样加入含枸橼酸钠(3.13%)的抗凝管中，摇匀，按试剂盒(Becton Dickinson.USA)说明书操作。
1.2.4 组织形态学染色 术后4周，对肝脏、脾脏进行光镜取材，置于10%中性福尔马林溶液固定24h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块，切片、苏木素-伊红染色400倍光镜下观察。
1.3 统计学处理 计量资料采用x±s表示，用SPSS 10.0统计软件包处理数据。
2 结 果
2.1 术后大鼠血常规的变化 见表1。 表1 各组大鼠术后血常规的比较
2.2 术后4周IgM,IgA,IgG水平 见表2。 ECG组较NCG组显著降低，TSG组较ECG组IgM水平显著降低，IgA和IgG变化不明显。R50%NSG组与ECG组比较、RNSG组与NCG组比较，差异均无显著性。见表2。 表2 各组大鼠术后4周IgM,IgA,IgG水平比较
2.3 术后4周外周血T淋巴细胞亚群水平 见表3。 表3 各组大鼠术后4周外周血T淋巴细胞亚群比较
2.4 大鼠肝脏、脾脏病理学变化 ECG组肝脏光镜下见：假小叶内肝细胞索排列紊乱，小叶中央静脉缺如、偏位或出现两个以上的中央静脉，再生的肝细胞结节肝细胞索排列紊乱，胞体大，核大，着色深，肝细胞还出现气泡样变，脂肪变性等(图1)，TSG组R50%NSG组和RNSG组可见肝纤维化程度减轻(图2)。
ECG组和TSG组脾脏光镜下见：脾包膜增厚，脾实质充血严重，脾内纤维严重增生；白髓有不同程度萎缩，滤泡和生发中心变小，数量减少(图3)。R50%NSG组和RNSG组可见脾包膜变薄，脾实质轻度充血，以包膜下明显，轻度纤维化且有少量散在的小出血灶(图4)
3 讨 论
脾脏直接参于细胞介导免疫调节，对脾内及外周血内的免疫活性细胞的量和比例有重要的调节作用，脾脏内的T细胞占全身循环量的25%，B细胞占10%～15%[1]。脾脏通过T细胞和可溶性脾因子对其它淋巴组织细胞群的变化进行调控。大鼠切脾后出现Th细胞减少和Ts细胞增多，这种变化达2月之久[2]。这种脾切除后免疫活性细胞调控紊乱比例失调，可能导致T细胞亚群功能和免疫调节功能发生紊乱。Th细胞的辅助功能下降，Ts细胞的抑制作用降低。T淋巴细胞亚群的紊乱，常引起免疫应答的改变：(1)T细胞对有丝分裂素刺激的反应增殖能力低下；(2)Ts活性增强，Th和放大T细胞活性下降；(3)T细胞数量和亚群比例失调。本实验中。肝硬化PHT大鼠术前外周血的CD3+、CD4+、CD8+较NCG降低，全脾切除后外周血CD3+、CD4+、CD8+较脾大部切除后显著降低，且以CD4+降低尤为显著，说明了全脾切除后细胞免疫功能更趋恶化。但是，RMSG的CD3+、CD4+、CD8+术后和NCG比较无显著性差异，说明保留约正常脾脏大小的脾部分切除术在一定程度上能够维持机体的细胞免疫。
脾脏在机体免疫系统中占重要地位，是血源性抗原发生免疫应答的主要场所，又是产生抗体尤其是初级反应中IgM的主要基地[3～4]，IgM水平的下降，预示着体液免疫功能的低下。本实验中术后4周RNSG与NCG比较IgA、IgG、IgM无明显变化，而在TSG和R50%NSG，IgM有下降趋势，这说明脾脏切除者，可通过其它淋巴器官部分代偿，但IgM水平却无法恢复。这可能是因为产生IgM的B淋巴细胞亚群CD20+，CD21+主要存在于脾脏，脾脏是产生IgM的主要场所之缘故。
对于肝硬化PHT患者，多数学者认为保留部分脾脏能够消除脾亢，保留脾脏免疫功能，降低门静脉压力，余脾成为疏导处于高动力循环状态的门静脉血流的通道[5，6]。保留过多，脾亢得不到纠正，过少则不能很好地保留脾功能，通过侧支循环所起到的分流降压作用亦较少[7]。大量的实验和临床研究表明，PHT病人的整个免疫功能均低下，但作为机体最大的外周淋巴器官的脾脏，仍对病人的体液免疫和和细胞免疫具有重要的调控作用，且具有强大的抗感染等免疫功能。从本实验结果看出，残余脾脏具有一定的生理功能，保留部分脾脏大小的脾部分切除术在一定程度上能够维持机体的体液免疫和细胞免疫功能。
参 考 文 献
[1]Petroianu A.Subtotal splenectomy for treatment of retarted growth and sexual development associated with splenomegaly[J].Minerva Chir,2003,(3)：413414.
[2]葛依工，高翰，孔宪铸.脾脏切除术对大鼠外周血T细胞亚群变化影响的动态观察[J].中国免疫学杂志，1998，4(10)：1820.
[3]Petroianu A,Berindoague Neto R.Laparoscopic subtotal splenectomy[J].Minerva Chir,2004,59(5):501505.
[4]Tatulli F,Ciani V,Caputi A,et al.Subtotal splenectomy for large splenic cyst[J].Chir Ital,2003，(5)：761764.
[5]杨新华，马宏敏，蔡志民.脾大部切除术治疗肝硬化脾大脾亢的疗效分析[J].中华肝胆外科杂志，2000,(6):339341.
[6]王国梁，张燕.脾损伤自体脾组织移植的临床应用[J].中国现代普通外科进展，2002，5(2)：105.
[7]Stoehr GA,Stauffer UG,Eber SW.Neartotal splenectomy:a new technique for the management of hereditary spherocytosis[J].Ann Surg,2005，214(1)：4047.
1中国医科大学附属第一医院 普外三科 (辽宁 沈阳 110001)
2佳木斯大学附属第一医院 普通外科 (黑龙江 佳木斯 154003), http://www.100md.com(刘程伟 张雪松 王树卿 罗维 张强)
【关键词】脾次全切除术·门静脉高压症，门静脉·免疫功能
The influence of subtotal splenectomy on partial immunlogical function in rats with poroal hypertension
LIU Chengwei1,ZHANG Xuesong2,WANG Shuqing2,LUO Wei2，ZHANG Qiang1
1Department of Third General Surgery,the First Affiliated Hospital,China Medical University (Shenyang 110001,China)
2Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital,Jiamusi University(Jiamusi 154003,China)
【ABSTRACT】Objective:To detect the change of cell immunity and body fluid immunity after subtotal splenectomy in portal hypertension of rat ,and preliminarily evaluate the role of subtotal splenectomy in portal hypertension.Methods:We established the rat model of hepatic cirrhosis portal hypertension.Rats were divided to five groups:normal control group(NCG);experimental control group(ECG),total splenectomy group(TSG),retain fifty percent size of normal spleen group(R50%NSG),retain the same size of normal spleen group(RNSG).Measured the Blood routine,Immunoglobulin,T Iymphocyte subgroup and stained with hematoxylin and eosin (HE) at 4 weeks after surgery.Results:There were not significant different between RNSG and NCG in Blood routine,Immunoglobulin,T Iymphocyte subgroup at 4 weeks after operation.ECGcould be seen by light microscope that the tissue of normal hepatic lobule was destructed,and appeared pseudolobule.Disarrangement of regenerated hepatic cell nodus and liver cell cord,fatty degeneration in hepatic cell,thickening of spleen capsule and serious congestion of spleen parenchyma,atrophy of white pulp and shrinking of follicle and germinal center R50%NSG and RNSG could be seen that hepatic fibrosis,spleen capsule thichening and congesition of splenic parenchyma to a less extent.Conclusion:Remaining spleen of portal hypertension caused by hepatic cirrhosis has physiology functions.In some degree,splenectomy of retaining the same size of normal spleen could maintain body fluid immunity and cell immunity of organism.
【KEY WORDS】Subtotal splenectomy·Portal hypertension·Immunological function
门脉高压症(portal hypertension,PHT)表现有脾大和脾功能亢进，食管胃底静脉曲张和呕血、腹水等症状。脾脏切除是其治疗方法之一，但对于脾脏的“切”和“保”尚存在分岐。本文研究门脉高压症脾次全切除术后实际免疫功能的变化，以期为临床治疗提供参数。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备与分组 健康雄性Wistar大鼠100只，体重200～250g。建立PHT大鼠模型：大鼠腹部皮下注射60%CCl4(0.3ml/100g)油溶液，首次剂量加倍(0.5ml/100g)，每4日1次，共15次，同时10%乙醇溶液代替饮水，60d后随机抽样10只，测量门静脉压≥12mmHg(腹腔注射麻醉后，打开腹腔暴露门脉主干，于肠系膜前静脉右侧靠近门脉处分离出一回肠肠系膜静脉分支，结扎其远端，然后用血管剪剪开一适宜缺口，将PE100导管自缺口插入后，沿肠系膜前静脉上行，通过脾静脉至门脉主干，固定导管并接通压力换能器测量门静脉压力)及病理证实大鼠肝硬化PHT模型成功(建模过程中死亡35只)。实验共分5组(10只/组)：①正常对照组(NCG)：自由饮食的正常大鼠，10%水合氯醛水溶液300mg/kg腹腔注射麻醉后，剖腹切除部分大网膜；②实验对照组(ECG)：PHT大鼠，麻醉后剖腹切除部分大网膜；③全脾切除组(TSG)：PHT大鼠，麻醉后剖腹，1号丝线双重结扎脾门血管，行全脾切除，如有副脾一并切除；④R50%NSG组PHT大鼠，麻醉后剖腹，切除脾上极大部分，保留脾下极组织体积约为正常脾脏的50%；⑤RNSG组：PHT大鼠，麻醉后剖腹，切除脾上极大部分，保留脾下极组织体积约为正常脾脏大小。
1.2 指标与测定方法
1.2.1 血常规的测定 各组术后2、3、4周经大鼠内眦静脉用细玻璃管采血，每次1ml置于含肝素的抗凝管中，利用Sysmex kx21仪器，电阻法(测血球计数)和比色法(测血红蛋白)测定。
1.2.2 免疫球蛋白的测定 术后4周，取待测血清0.1ml，加生理盐水0.3ml混匀，测IgG、 IgA各取10μl，测IgM取20μl，分别注入G、A、M板孔中，放入37℃培养箱内，48h后观察结果，测沉淀直径与对应标准曲线中查出免疫球蛋白的含量。
1.2.3 T淋巴细胞亚群测定 待测血样加入含枸橼酸钠(3.13%)的抗凝管中，摇匀，按试剂盒(Becton Dickinson.USA)说明书操作。
1.2.4 组织形态学染色 术后4周，对肝脏、脾脏进行光镜取材，置于10%中性福尔马林溶液固定24h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块，切片、苏木素-伊红染色400倍光镜下观察。
1.3 统计学处理 计量资料采用x±s表示，用SPSS 10.0统计软件包处理数据。
2 结 果
2.1 术后大鼠血常规的变化 见表1。 表1 各组大鼠术后血常规的比较
2.2 术后4周IgM,IgA,IgG水平 见表2。 ECG组较NCG组显著降低，TSG组较ECG组IgM水平显著降低，IgA和IgG变化不明显。R50%NSG组与ECG组比较、RNSG组与NCG组比较，差异均无显著性。见表2。 表2 各组大鼠术后4周IgM,IgA,IgG水平比较
2.3 术后4周外周血T淋巴细胞亚群水平 见表3。 表3 各组大鼠术后4周外周血T淋巴细胞亚群比较
2.4 大鼠肝脏、脾脏病理学变化 ECG组肝脏光镜下见：假小叶内肝细胞索排列紊乱，小叶中央静脉缺如、偏位或出现两个以上的中央静脉，再生的肝细胞结节肝细胞索排列紊乱，胞体大，核大，着色深，肝细胞还出现气泡样变，脂肪变性等(图1)，TSG组R50%NSG组和RNSG组可见肝纤维化程度减轻(图2)。
ECG组和TSG组脾脏光镜下见：脾包膜增厚，脾实质充血严重，脾内纤维严重增生；白髓有不同程度萎缩，滤泡和生发中心变小，数量减少(图3)。R50%NSG组和RNSG组可见脾包膜变薄，脾实质轻度充血，以包膜下明显，轻度纤维化且有少量散在的小出血灶(图4)
3 讨 论
脾脏直接参于细胞介导免疫调节，对脾内及外周血内的免疫活性细胞的量和比例有重要的调节作用，脾脏内的T细胞占全身循环量的25%，B细胞占10%～15%[1]。脾脏通过T细胞和可溶性脾因子对其它淋巴组织细胞群的变化进行调控。大鼠切脾后出现Th细胞减少和Ts细胞增多，这种变化达2月之久[2]。这种脾切除后免疫活性细胞调控紊乱比例失调，可能导致T细胞亚群功能和免疫调节功能发生紊乱。Th细胞的辅助功能下降，Ts细胞的抑制作用降低。T淋巴细胞亚群的紊乱，常引起免疫应答的改变：(1)T细胞对有丝分裂素刺激的反应增殖能力低下；(2)Ts活性增强，Th和放大T细胞活性下降；(3)T细胞数量和亚群比例失调。本实验中。肝硬化PHT大鼠术前外周血的CD3+、CD4+、CD8+较NCG降低，全脾切除后外周血CD3+、CD4+、CD8+较脾大部切除后显著降低，且以CD4+降低尤为显著，说明了全脾切除后细胞免疫功能更趋恶化。但是，RMSG的CD3+、CD4+、CD8+术后和NCG比较无显著性差异，说明保留约正常脾脏大小的脾部分切除术在一定程度上能够维持机体的细胞免疫。
脾脏在机体免疫系统中占重要地位，是血源性抗原发生免疫应答的主要场所，又是产生抗体尤其是初级反应中IgM的主要基地[3～4]，IgM水平的下降，预示着体液免疫功能的低下。本实验中术后4周RNSG与NCG比较IgA、IgG、IgM无明显变化，而在TSG和R50%NSG，IgM有下降趋势，这说明脾脏切除者，可通过其它淋巴器官部分代偿，但IgM水平却无法恢复。这可能是因为产生IgM的B淋巴细胞亚群CD20+，CD21+主要存在于脾脏，脾脏是产生IgM的主要场所之缘故。
对于肝硬化PHT患者，多数学者认为保留部分脾脏能够消除脾亢，保留脾脏免疫功能，降低门静脉压力，余脾成为疏导处于高动力循环状态的门静脉血流的通道[5，6]。保留过多，脾亢得不到纠正，过少则不能很好地保留脾功能，通过侧支循环所起到的分流降压作用亦较少[7]。大量的实验和临床研究表明，PHT病人的整个免疫功能均低下，但作为机体最大的外周淋巴器官的脾脏，仍对病人的体液免疫和和细胞免疫具有重要的调控作用，且具有强大的抗感染等免疫功能。从本实验结果看出，残余脾脏具有一定的生理功能，保留部分脾脏大小的脾部分切除术在一定程度上能够维持机体的体液免疫和细胞免疫功能。
参 考 文 献
[1]Petroianu A.Subtotal splenectomy for treatment of retarted growth and sexual development associated with splenomegaly[J].Minerva Chir,2003,(3)：413414.
[2]葛依工，高翰，孔宪铸.脾脏切除术对大鼠外周血T细胞亚群变化影响的动态观察[J].中国免疫学杂志，1998，4(10)：1820.
[3]Petroianu A,Berindoague Neto R.Laparoscopic subtotal splenectomy[J].Minerva Chir,2004,59(5):501505.
[4]Tatulli F,Ciani V,Caputi A,et al.Subtotal splenectomy for large splenic cyst[J].Chir Ital,2003，(5)：761764.
[5]杨新华，马宏敏，蔡志民.脾大部切除术治疗肝硬化脾大脾亢的疗效分析[J].中华肝胆外科杂志，2000,(6):339341.
[6]王国梁，张燕.脾损伤自体脾组织移植的临床应用[J].中国现代普通外科进展，2002，5(2)：105.
[7]Stoehr GA,Stauffer UG,Eber SW.Neartotal splenectomy:a new technique for the management of hereditary spherocytosis[J].Ann Surg,2005，214(1)：4047.
1中国医科大学附属第一医院 普外三科 (辽宁 沈阳 110001)
2佳木斯大学附属第一医院 普通外科 (黑龙江 佳木斯 154003), http://www.100md.com(刘程伟 张雪松 王树卿 罗维 张强)