补肾生血药促进大鼠缺血后肢血管新生的实验研究
【摘要】目的：探讨补肾生血药对缺血后肢大鼠外周循环中骨髓来源内皮祖细胞(EPC)的影响及缺血组织血管新生的影响。方法：建立大鼠后肢缺血模型，喂食补肾生血药，1周后细胞培养观察外周血EPC数量变化，4周后检测缺血组织微血管密度及血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果：实验组大鼠外周血培养的EPC(89.1±10.3/mm2)明显高于对照组(48.6±7.5/mm2)(P<0.01)，缺血组织微血管密度(288.76±12.54)和VEGF表达(0.233±0.014)均高于对照组(224.84±5.87),(0.162±0.018,P<0.05)，且外周血EPC数量与微血管密度之间具有显著相关性(P<0.01)。结论：补肾生血药通过动员骨髓EPC的迁移、分化、促进局部的血管新生，达到改善供血目的。
【关键词】植物药疗法·缺血·四肢·内皮祖细胞·新生血管化，生理性·血管·内皮生长因子
Effect of Bushenshengxue traditiond medicine on angiogenesis of ischemic hindlimbs in rats
LIANG Tiancheng1,HUANG Jiaying1,XIANG You1,LIU Yong2,SU Song2
1Department of Surgery,Luzhou Hospital for Traditional Chinese Medicine(Sichuan
646000,China)
2Department of Vascular Surgery,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College
(Sichuan 646000,China)
【ABSTRACT】Objective:To explore the effect of limb ischemia on mobilization of bone marrow derivedendothelial pregenitor cells(EPCs) and neovascularization of ischemic tissue with traditional medicine.Methods:Unilateral ischemic model of the hindlimbs was produced by excision of the common and superficial femoral artery in 20 male rats.The other 20 animals served as the control group.At 1 week after operation the changing of the circulating EPCs was observed by mononuclear cells culture.Microvesseldensity,the VEGF expression and angiograph of ischemic limbs was detected at week 4.Results:The number of circulating EPCs in experiment group (89.1±10.3/mm2 VS 48.6±7.5/mm2,P<0.01).Microvessel density of ischemic limbs was significantly higher than that in control group (288.76±12.54/mm2 VS 224.86±5.87/mm2,P<0.01).The VEGF expression in experiment group was significantly higer than that in control group (A:0.233±0.014 VS 0.162±0.0186,P<0.01).The number of circulating EPCs was greatly related to the microvessel density and VEGF expression (P<0.01).Conclusion:Local perfusion of ischemic limb can be augmented by improving neovascularization with EPCs mobilization of bushenshengxue traditional medicine.
【KEY WORDS】Phytotherapy·Extremities·Endothelial progenitor cells·Neovascularization,physiologic·Blood vessels·Endothelial growth factors 内皮祖细胞(endothelial progenitor cell ,EPC)是一种能定向分化为血管内皮细胞的前体细胞，主要存在于骨髓内，可参与机体在特定条件下的新血管生成，改善缺血组织的血液循环，EPC有望成为缺血性疾病新的治疗靶点。我们建立大鼠后肢缺血模型，应用中药补肾生血方剂，观察其对EPC和促进缺血组织血管新生的作用。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 兔抗鼠CD34多克隆抗体，SantCruz公司提供；兔抗鼠VEGF、bFGF多抗，由武汉博士德公司提供；荧光素FITC标记的羊抗兔IgG购自Sigma公司；SABC试剂盒购自武汉博士德公司。补肾生血胶囊：由熟地、枸杞子、龟板胶、当归、山茱萸、黄芪等11味中药组成，由中国中医研究院西苑医院提供，稀释至适量(含生药1.7g/ml)。
1.1.2 动物 健康成年SD大鼠，由本院实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 大鼠后肢缺血模型建立 成年健康SD大鼠40只，体重(200±5)g。采用切断、结扎单侧股总、股浅动脉建立肢体缺血模型，继续饲养1周，彩超检查证实缺血模型建立成功，随机分实验组、对照组各20只。实验组每天喂食补肾生血药提取液1ml(含生药1.7g，相当于成人用量1.7g/kg的5倍)，对照组予等量蒸馏水，连续喂食20d。
1.2.2 外周血内皮祖细胞培养及鉴定 喂食1周后，取两组大鼠各10只，无菌条件下心脏采血3ml，抗凝后生理盐水1∶1稀释，沿离心管壁缓慢加在3ml NycoprepTM1.077A动物单核细胞分离液的界面上，密度梯度离心法分离，2000r/min，20min，吸出分离液与血浆之间的单核细胞层，PBS洗涤2次，加含15%胎牛血清的1∶1 DMEMIMDM 培养液混合，制成细胞悬液。将多聚赖氨酸处理后的2.0cm×2.0cm盖玻片置于6孔培养板中，调整细胞浓度为1×106，接种于6孔培养板内，每孔2.5ml。置37℃ 5%CO2孵箱内培养，2d后更换培养液，弃去悬浮细胞，继续再培养2d。①细胞形态学：细胞培养4d后在倒置相差显微镜下观察活细胞的贴壁情况、细胞形态学变化。②细胞免疫化学检测：细胞培养后4d，取出盖玻片，PBS漂洗，95%冷乙醇固定，再次PBS漂洗，分别滴加第一抗体：兔抗鼠CD34多抗(1∶200)，湿盒内4℃冰箱过夜。PBS振洗后，加入异硫氰酸标记的二抗 50μl(FITCIgG)，湿盒内37℃孵育1h，PBS洗涤后立即荧光显微镜下观察、摄片。阴性对照以PBS代替一抗。
由2名观察者独立对每块盖坡片上的染色阳性细胞进行记数，随机选取5个视野，换上带有标尺的目镜，200倍视野下观察单位面积内阳性细胞数，取平均值为单位面积EPC细胞数。
将剩余的大鼠喂食至术后4周，处死，于缺血后肢内侧切取内收肌组织块，放入4%多聚甲醛(pH7.2)中固定24h，石蜡包埋，制成5μm厚组织切片备用。
1.2.3 微血管密度(MVD)及VEGF检测 依照免疫组化ABC法，一抗分别为兔抗鼠VWF(Ven willebrand factor)因子、兔抗鼠VEGF(1∶100)抗体，二抗为即用型SABC试剂盒，依说明书进行操作。苏木素轻度复染，脱水，透明，树脂封片。阴性对照以PBS代替一抗。
1.2.4 免疫组化结果判断 以胞浆呈棕黄色染色者为内皮细胞VWF表达阳性，对VWF阳性进行微血管记数。200倍下随机选5个视野，记数微血管数目。以与周围组织明显区别的1个棕黄色染色的内皮细胞或细胞丛为1个微血管，只要结构不相连，其分支结构也可作为1个血管，染色模糊或分辨不清者不记入内，凡管腔大于8个红细胞大小，带有肌层的血管不予记数。2名观察者采用双盲法对同一切片记数，取二者的平均值为该片的MVD。
胞浆呈棕黄色染色者为VEGF表达阳性，采用美国计算机图像分析系统ImaginePro Plus，每个样本200倍下随机扫描10个视野，取其平均值作为该样本的VEGF的光密度值。
1.3 统计学分析 采用SPSS统计软件处理数据，计量资料采用x±s表示，组内资料采用t检验，Spearman非参数秩和相关性检验统计分析。
2 结 果
2.1 大体观察 所有大鼠均存活，造模10d后二组大鼠缺血后肢端均有毛发脱落、稀疏，毛皮发亮，两组共有5只出现趾端肿胀、坏疽、趾甲缺损脱落，10~14d后均坏疽脱落，创口自愈。
2.2 EPC体外培养观察 外周血中的单核细胞接种5h后，部分细胞即开始贴壁，2d后贴壁的单核细胞逐渐伸长变型，呈纺锤型，两端有突起伸出，核清晰呈圆形或卵圆形，5d后开始出现细胞分裂。培养4d的贴壁细胞经CD34免疫荧光标记，阳性细胞呈黄绿色强荧光。实验组EPC数目(89.1±10.3/mm2)明显高于对照组(48.6±7.5/mm2)(P<0.01)。见图1、2。
2.3 组织MVD及VEGF的表达 两组均可见大量新生血管，主要分布在肌间隙内，血管壁被覆1~数个内皮细胞，CD34表达阳性，表现为胞浆呈棕黄色，内充数个红细胞，实验组MVD高于对照组。两组切片可见骨骼肌细胞，内皮细胞内有棕黄色颗粒沉着，棕黄色颗粒呈条带状分布于胞浆内，两组光密度值(OD)差异有统计学意义。外周血EPC与MVD有极显著相关性，见表1，图3。图2 CD34阳性，可见内皮细胞胞浆被染成棕黄色(×200)表1 大鼠外周血EPC、缺血组织MVD及VEGF光密度值图3 VEGF染色阳性，骨骼肌胞浆内可见棕黄色颗粒(×200)
3 讨 论
严重肢体缺血性疾病目前尚无确切有效治疗方法，经治疗促进血管新生是挽救缺血肢体的希望所在[1，2]。研究表明，利用血管生长因子或其基因，能明显增加促进缺血部位的侧支循环，改善供血。目前发现，这些血管生长因子的促血管新生作用，实质是动员了骨髓EPC而发挥其生血管效应的。
EPC是一种能定向分化为血管内皮细胞的前体细胞，在胚胎发育过程中，由造血干细胞分化而来，参与胎儿期的血管发育。最近发现成年个体中也存在EPC，且同样可参与成年机体特定条件下(缺血、创伤、炎症、肿瘤等)的血管新生，通过骨髓EPC的释放入血，再定向迁移到缺血部位，增殖、分化为内皮细胞(EC)直接参与新血管生成。另外，EPC及分化后的EC，还通过旁分泌形式产生多种血管生长因子，进一步促进局部血管新生，改善组织供血。体外培养的EPC与EC形态相似，呈纺锤型贴壁生长，均能表达CD34、CD31、血管内皮生长因子受体1(Flk1)等，但外周血中成熟内皮细胞含量极少(约2~3个/ml)，与EPC相差悬殊(约500~1000/ml)[3]，故本实验以CD34+细胞来计数EPC基本准确。
目前证实多种生长因子或药物具有动员EPC作用，如血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒巨细胞集落刺激因子(GMCSF)及他汀类药物等，并可显著促进缺血组织的血管新生，因此，EPC动员可能是重症缺血性疾病极有前途的治疗措施[4，5]。
传统医学治疗血管生成相关病症有着悠久的历史，中医理论中，“气血相关”、“补气活血”、“行气通脉”等治则与相关方药，均可能具有促血管新生作用。补肾生血方剂是根据中医肾生髓理论，在多年实践基础上总结出来的有效方剂，具有滋阴养肾，填精生血、平衡阴阳、延缓衰老等的功效，近年研究表明该方药能促进骨髓细胞增生[6]，增加去卵巢大鼠子宫毛细血管的生成，且局部VEGF、bFGF表达增加[7，8]，提示该药有促血管生成效应。我们建立大鼠后肢缺血模型，发现喂食该药大鼠的缺血肢体微血管密度、局部VEGF表达均较对照组明显增加，外周血EPC数量亦显著增高，且二者具有相关性，证实该药经过EPC动员，进而促进缺血肢体的血管新生。因此，推测该方的促血管新生机制，极可能是通过某种激活途经，提高机体血液某种血管生长因子浓度，再动员EPC定向迁移、分化，促进缺血部位的血管新生。但其促血管新生的具体机制，仍有待进一步研究证实。
参 考 文 献
[1]Isner JM,Asahara T.Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularization[J].J Clin Invest,1999,103:12311236.
[2]张易来，张亮，宋惠民，等.CO2促缺血下肢侧支循环建立的实验研究[J].中国现代普通外科进展，2005，8(4)：227.
[3]Shi BQ,Rafii S,Wu MH,et al.Evidence for circulating bone marrowderived endothelial cells[J].Blood,1998,92:362367.
[4]Asahara T,Takahashi T,Masuda H,et al.VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrowderived endothelial progenitor cells[J].EMBO J,1999,18:39643972.
[5]Vasa M,Fichtlscherer S,Adler K,et al.Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease[J].Circulation,2001,101:28852890.
[6]吴志奎，危巍，何忠效，等.肾生髓理论分子基础的研究[J].中医杂志，1996，37(2)：109110.
[7]王蕾，吕鑫霞，吴志奎，等.补肾生血药对金黄地鼠子宫组织bFGF、VEGF表达水平的影响[J].中国中医基础医学杂志,2000，12：795798.
[8]张树成，吴志奎，王蕾，等.补肾生血和补肾调经方药促血管生成作用实验研究[J].中医杂志，2000，41(6)：369370.
1四川省泸州市中医院 外科 (四川 泸州 646000)
2泸洲医学院附属医院 血管外科 (四川 泸州 646000), http://www.100md.com(梁天成 黄家应 向友 刘勇 苏松)
【关键词】植物药疗法·缺血·四肢·内皮祖细胞·新生血管化，生理性·血管·内皮生长因子
Effect of Bushenshengxue traditiond medicine on angiogenesis of ischemic hindlimbs in rats
LIANG Tiancheng1,HUANG Jiaying1,XIANG You1,LIU Yong2,SU Song2
1Department of Surgery,Luzhou Hospital for Traditional Chinese Medicine(Sichuan
646000,China)
2Department of Vascular Surgery,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College
(Sichuan 646000,China)
【ABSTRACT】Objective:To explore the effect of limb ischemia on mobilization of bone marrow derivedendothelial pregenitor cells(EPCs) and neovascularization of ischemic tissue with traditional medicine.Methods:Unilateral ischemic model of the hindlimbs was produced by excision of the common and superficial femoral artery in 20 male rats.The other 20 animals served as the control group.At 1 week after operation the changing of the circulating EPCs was observed by mononuclear cells culture.Microvesseldensity,the VEGF expression and angiograph of ischemic limbs was detected at week 4.Results:The number of circulating EPCs in experiment group (89.1±10.3/mm2 VS 48.6±7.5/mm2,P<0.01).Microvessel density of ischemic limbs was significantly higher than that in control group (288.76±12.54/mm2 VS 224.86±5.87/mm2,P<0.01).The VEGF expression in experiment group was significantly higer than that in control group (A:0.233±0.014 VS 0.162±0.0186,P<0.01).The number of circulating EPCs was greatly related to the microvessel density and VEGF expression (P<0.01).Conclusion:Local perfusion of ischemic limb can be augmented by improving neovascularization with EPCs mobilization of bushenshengxue traditional medicine.
【KEY WORDS】Phytotherapy·Extremities·Endothelial progenitor cells·Neovascularization,physiologic·Blood vessels·Endothelial growth factors 内皮祖细胞(endothelial progenitor cell ,EPC)是一种能定向分化为血管内皮细胞的前体细胞，主要存在于骨髓内，可参与机体在特定条件下的新血管生成，改善缺血组织的血液循环，EPC有望成为缺血性疾病新的治疗靶点。我们建立大鼠后肢缺血模型，应用中药补肾生血方剂，观察其对EPC和促进缺血组织血管新生的作用。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 兔抗鼠CD34多克隆抗体，SantCruz公司提供；兔抗鼠VEGF、bFGF多抗，由武汉博士德公司提供；荧光素FITC标记的羊抗兔IgG购自Sigma公司；SABC试剂盒购自武汉博士德公司。补肾生血胶囊：由熟地、枸杞子、龟板胶、当归、山茱萸、黄芪等11味中药组成，由中国中医研究院西苑医院提供，稀释至适量(含生药1.7g/ml)。
1.1.2 动物 健康成年SD大鼠，由本院实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 大鼠后肢缺血模型建立 成年健康SD大鼠40只，体重(200±5)g。采用切断、结扎单侧股总、股浅动脉建立肢体缺血模型，继续饲养1周，彩超检查证实缺血模型建立成功，随机分实验组、对照组各20只。实验组每天喂食补肾生血药提取液1ml(含生药1.7g，相当于成人用量1.7g/kg的5倍)，对照组予等量蒸馏水，连续喂食20d。
1.2.2 外周血内皮祖细胞培养及鉴定 喂食1周后，取两组大鼠各10只，无菌条件下心脏采血3ml，抗凝后生理盐水1∶1稀释，沿离心管壁缓慢加在3ml NycoprepTM1.077A动物单核细胞分离液的界面上，密度梯度离心法分离，2000r/min，20min，吸出分离液与血浆之间的单核细胞层，PBS洗涤2次，加含15%胎牛血清的1∶1 DMEMIMDM 培养液混合，制成细胞悬液。将多聚赖氨酸处理后的2.0cm×2.0cm盖玻片置于6孔培养板中，调整细胞浓度为1×106，接种于6孔培养板内，每孔2.5ml。置37℃ 5%CO2孵箱内培养，2d后更换培养液，弃去悬浮细胞，继续再培养2d。①细胞形态学：细胞培养4d后在倒置相差显微镜下观察活细胞的贴壁情况、细胞形态学变化。②细胞免疫化学检测：细胞培养后4d，取出盖玻片，PBS漂洗，95%冷乙醇固定，再次PBS漂洗，分别滴加第一抗体：兔抗鼠CD34多抗(1∶200)，湿盒内4℃冰箱过夜。PBS振洗后，加入异硫氰酸标记的二抗 50μl(FITCIgG)，湿盒内37℃孵育1h，PBS洗涤后立即荧光显微镜下观察、摄片。阴性对照以PBS代替一抗。
由2名观察者独立对每块盖坡片上的染色阳性细胞进行记数，随机选取5个视野，换上带有标尺的目镜，200倍视野下观察单位面积内阳性细胞数，取平均值为单位面积EPC细胞数。
将剩余的大鼠喂食至术后4周，处死，于缺血后肢内侧切取内收肌组织块，放入4%多聚甲醛(pH7.2)中固定24h，石蜡包埋，制成5μm厚组织切片备用。
1.2.3 微血管密度(MVD)及VEGF检测 依照免疫组化ABC法，一抗分别为兔抗鼠VWF(Ven willebrand factor)因子、兔抗鼠VEGF(1∶100)抗体，二抗为即用型SABC试剂盒，依说明书进行操作。苏木素轻度复染，脱水，透明，树脂封片。阴性对照以PBS代替一抗。
1.2.4 免疫组化结果判断 以胞浆呈棕黄色染色者为内皮细胞VWF表达阳性，对VWF阳性进行微血管记数。200倍下随机选5个视野，记数微血管数目。以与周围组织明显区别的1个棕黄色染色的内皮细胞或细胞丛为1个微血管，只要结构不相连，其分支结构也可作为1个血管，染色模糊或分辨不清者不记入内，凡管腔大于8个红细胞大小，带有肌层的血管不予记数。2名观察者采用双盲法对同一切片记数，取二者的平均值为该片的MVD。
胞浆呈棕黄色染色者为VEGF表达阳性，采用美国计算机图像分析系统ImaginePro Plus，每个样本200倍下随机扫描10个视野，取其平均值作为该样本的VEGF的光密度值。
1.3 统计学分析 采用SPSS统计软件处理数据，计量资料采用x±s表示，组内资料采用t检验，Spearman非参数秩和相关性检验统计分析。
2 结 果
2.1 大体观察 所有大鼠均存活，造模10d后二组大鼠缺血后肢端均有毛发脱落、稀疏，毛皮发亮，两组共有5只出现趾端肿胀、坏疽、趾甲缺损脱落，10~14d后均坏疽脱落，创口自愈。
2.2 EPC体外培养观察 外周血中的单核细胞接种5h后，部分细胞即开始贴壁，2d后贴壁的单核细胞逐渐伸长变型，呈纺锤型，两端有突起伸出，核清晰呈圆形或卵圆形，5d后开始出现细胞分裂。培养4d的贴壁细胞经CD34免疫荧光标记，阳性细胞呈黄绿色强荧光。实验组EPC数目(89.1±10.3/mm2)明显高于对照组(48.6±7.5/mm2)(P<0.01)。见图1、2。
2.3 组织MVD及VEGF的表达 两组均可见大量新生血管，主要分布在肌间隙内，血管壁被覆1~数个内皮细胞，CD34表达阳性，表现为胞浆呈棕黄色，内充数个红细胞，实验组MVD高于对照组。两组切片可见骨骼肌细胞，内皮细胞内有棕黄色颗粒沉着，棕黄色颗粒呈条带状分布于胞浆内，两组光密度值(OD)差异有统计学意义。外周血EPC与MVD有极显著相关性，见表1，图3。图2 CD34阳性，可见内皮细胞胞浆被染成棕黄色(×200)表1 大鼠外周血EPC、缺血组织MVD及VEGF光密度值图3 VEGF染色阳性，骨骼肌胞浆内可见棕黄色颗粒(×200)
3 讨 论
严重肢体缺血性疾病目前尚无确切有效治疗方法，经治疗促进血管新生是挽救缺血肢体的希望所在[1，2]。研究表明，利用血管生长因子或其基因，能明显增加促进缺血部位的侧支循环，改善供血。目前发现，这些血管生长因子的促血管新生作用，实质是动员了骨髓EPC而发挥其生血管效应的。
EPC是一种能定向分化为血管内皮细胞的前体细胞，在胚胎发育过程中，由造血干细胞分化而来，参与胎儿期的血管发育。最近发现成年个体中也存在EPC，且同样可参与成年机体特定条件下(缺血、创伤、炎症、肿瘤等)的血管新生，通过骨髓EPC的释放入血，再定向迁移到缺血部位，增殖、分化为内皮细胞(EC)直接参与新血管生成。另外，EPC及分化后的EC，还通过旁分泌形式产生多种血管生长因子，进一步促进局部血管新生，改善组织供血。体外培养的EPC与EC形态相似，呈纺锤型贴壁生长，均能表达CD34、CD31、血管内皮生长因子受体1(Flk1)等，但外周血中成熟内皮细胞含量极少(约2~3个/ml)，与EPC相差悬殊(约500~1000/ml)[3]，故本实验以CD34+细胞来计数EPC基本准确。
目前证实多种生长因子或药物具有动员EPC作用，如血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒巨细胞集落刺激因子(GMCSF)及他汀类药物等，并可显著促进缺血组织的血管新生，因此，EPC动员可能是重症缺血性疾病极有前途的治疗措施[4，5]。
传统医学治疗血管生成相关病症有着悠久的历史，中医理论中，“气血相关”、“补气活血”、“行气通脉”等治则与相关方药，均可能具有促血管新生作用。补肾生血方剂是根据中医肾生髓理论，在多年实践基础上总结出来的有效方剂，具有滋阴养肾，填精生血、平衡阴阳、延缓衰老等的功效，近年研究表明该方药能促进骨髓细胞增生[6]，增加去卵巢大鼠子宫毛细血管的生成，且局部VEGF、bFGF表达增加[7，8]，提示该药有促血管生成效应。我们建立大鼠后肢缺血模型，发现喂食该药大鼠的缺血肢体微血管密度、局部VEGF表达均较对照组明显增加，外周血EPC数量亦显著增高，且二者具有相关性，证实该药经过EPC动员，进而促进缺血肢体的血管新生。因此，推测该方的促血管新生机制，极可能是通过某种激活途经，提高机体血液某种血管生长因子浓度，再动员EPC定向迁移、分化，促进缺血部位的血管新生。但其促血管新生的具体机制，仍有待进一步研究证实。
参 考 文 献
[1]Isner JM,Asahara T.Angiogenesis and vasculogenesis as therapeutic strategies for postnatal neovascularization[J].J Clin Invest,1999,103:12311236.
[2]张易来，张亮，宋惠民，等.CO2促缺血下肢侧支循环建立的实验研究[J].中国现代普通外科进展，2005，8(4)：227.
[3]Shi BQ,Rafii S,Wu MH,et al.Evidence for circulating bone marrowderived endothelial cells[J].Blood,1998,92:362367.
[4]Asahara T,Takahashi T,Masuda H,et al.VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrowderived endothelial progenitor cells[J].EMBO J,1999,18:39643972.
[5]Vasa M,Fichtlscherer S,Adler K,et al.Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease[J].Circulation,2001,101:28852890.
[6]吴志奎，危巍，何忠效，等.肾生髓理论分子基础的研究[J].中医杂志，1996，37(2)：109110.
[7]王蕾，吕鑫霞，吴志奎，等.补肾生血药对金黄地鼠子宫组织bFGF、VEGF表达水平的影响[J].中国中医基础医学杂志,2000，12：795798.
[8]张树成，吴志奎，王蕾，等.补肾生血和补肾调经方药促血管生成作用实验研究[J].中医杂志，2000，41(6)：369370.
1四川省泸州市中医院 外科 (四川 泸州 646000)
2泸洲医学院附属医院 血管外科 (四川 泸州 646000), http://www.100md.com(梁天成 黄家应 向友 刘勇 苏松)