二维三七桂利嗪胶囊对急性脑缺血的保护作用
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肖湘华 ,邓秀玲 ,王 燕 ,刘俊田 ,王竹筠
二维三七桂利嗪胶囊;急性脑缺血;神经保护作用
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作者简介：肖湘华(1977)，男(汉族)，博士生，研究方向：心脑血管药理.
摘要：目的 观察二维三七桂利嗪胶囊对于急性脑缺血的影响。方法 ICR小鼠分别用420mg/kg、210mg/kg、105mg/kg的二维三七桂利嗪胶囊灌胃10d，观察断头后小鼠的喘息时间；SD大鼠分别用292mg/kg、146mg/kg、73mg/kg的二维三七桂利嗪胶囊灌胃10d，线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，然后进行神经行为指标评分、脑梗死范围测定和病理学观察。结果 二维三七桂利嗪胶囊各剂量组均能延长小鼠断头后的喘息时间，缩小局灶性脑缺血大鼠脑梗死范围，改善神经症状，减轻光镜下脑组织缺血性损伤。结论 二维三七桂利嗪胶囊对急性脑缺血损伤具有保护作用。
关键词：二维三七桂利嗪胶囊；急性脑缺血；神经保护作用
Protective effects of divitamins notonginseng and cinnarizine capsule against acute cerebra ischemiaXiao Xianghua, Deng Xiuling, Wang Yan, Liu Juntian, Wang Zhuyun
(1. Department of Pharmacology, Medical School of Xian Jiaotong Univesity, Xian 710061;
2. Libao Biochemical Pharmaceutical Company of Livzon Pharmaceutical Group, Zhuhai 519020, China)
ABSTRACT: Objective To investigate the effects of divitamins notonginseng and cinnarizine capsule(DNCC) on acute cerebral ischemia. Methods ICR mice were administered three doses of DNCC(420, 210, and 105mg/kg; ig.) for ten days, then the gasping time after decapitation was recorded. After three doses of DNCC(292, 146, and 73mg/kg; ig.) were given respectively for ten days in rats, the effects of DNCC on the infarct size, histological changes and neurological function scores caused by focal cerebral ischemia which was induced by middle cerebral artery occlusion were investigated. Results DNCC prolonged the gasping time of mice after decapitation and improved the neurological function scores, cerebral ischemia injury and decreased the infarct size in rats. Conclusion DNCC has a protective effect against acute cerebral ischemia.
KEY WORDS: divitamins notonginseng and cinnarizine capsule; acute cerebral ischemia; neuroprotective effect
二维三七桂利嗪胶囊(divitamins notonginseng and cinnarizine capsule, DNCC)是由桂利嗪、三七总皂苷、维生素E和维生素B6组成的中西药复方制剂，临床主要用于治疗缺血性脑血管病。实验证明钙通道阻滞剂能对抗缺血后脑内的低氧高糖状态，缩小脑梗死范围。三七总皂苷能减少大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)术后24h脑梗死范围，改善神经功能障碍及行为异常，减轻脑水肿，明显提高SOD活力，减轻脑梗死区的炎症反应。维生素E能提高缺血后机体的抗氧化能力，缩小脑梗死范围。但以上述成份组成的药物——DNCC对于脑缺血的影响尚未见报道。我们选择DNCC作为受试药物，分别采用小鼠断头法和线栓法诱导大鼠MCAO造成急性脑缺血模型，观察DNCC对于急性脑缺血的影响。
1 材料与方法
1.1 动物、药品与试剂 ICR小鼠，雌雄各半，体重18-22g；SD大鼠，雄性，体重200-300g，均由西安交通大学医学院实验动物中心提供。自然光周期饲养，大鼠术前8h禁食，自由饮水。二维三七桂利嗪胶囊(DNCC)，批号为030608；单组份桂利嗪(cinnarizine)，批号030651；单组份参三七提取物(extracts of panax notoginseng, EPN)，内含三七总皂苷54.46%，批号030506，以上药品均由丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司提供。桂利嗪胶囊(cinnarizine capsule, CC)，批号011001，丽珠集团利民制药厂生产。2，3，5三苯基氯化四氮唑(TTC)，批号F20030102，中国医药集团上海化学试剂公司生产。水合三氯乙醛，批号000530，北京市旭东化工厂生产。
1.2 仪器 GPS型双极电凝器，上海医用激光仪器厂生产；FA1004型电子天平，上海精密科学仪器有限公司生产；SHHW21420型三用电热恒温水浴箱，天津泰斯特仪器有限公司生产。
1.3 对小鼠脑缺血后存活时间的影响 ICR小鼠随机分为11组，每组13或14只，分别为阴性对照组(control)，阳性对照组(CC 390mg/kg)，大、中、小剂量DNCC组(DNCC 420mg/kg，210mg/kg，105mg/kg)，与DNCC大、中、小剂量相当的三个剂量的单组份桂利嗪组(cinnarizine 36mg/kg，18mg/kg，9mg/kg)和与DNCC大、中、小剂量相当的三个剂量的单组份参三七提取物组(EPN 72mg/kg，36mg/kg，18mg/kg)。各组分别以蒸馏水、桂利嗪胶囊(390mg/kg，相当于桂利嗪原料药45.5mg/kg)、大剂量(420mg/kg)、中剂量(210mg/kg)、小剂量(105mg/kg)的DNCC、与DNCC大、中、小剂量相当的三个剂量的单组份桂利嗪(分别为36mg/kg、18mg/kg、9mg/kg)及与DNCC大、中、小剂量相当的三个剂量的单组份参三七提取物(分别为72mg/kg、36mg/kg、18mg/kg)灌胃，连续10d，于末次给药后1h用剪刀在小鼠耳后2mm处快速断头，使头落到预热至37℃的水浴箱上，记录张口喘气的维持时间。
1.4 大鼠分组及脑缺血模型的制作 SD大鼠随机分为假手术组(sham)、模型对照组(model control)、阳性对照组(CC 270mg/kg，相当于原料药31.5mg/kg)、DNCC大剂量组(DNCC 292mg/kg，含桂利嗪原料药25mg/kg)、中剂量组(DNCC 146mg/kg)、小剂量组(DNCC 73mg/kg)及与DNCC大剂量相当的单组份桂利嗪组(cinnarizine 25mg/kg)，每组8-13只动物。连续灌胃10d，于末次给药后1h参考Longa等建立的方法，腹腔注射水合三氯乙醛(0.3mg/kg)麻醉大鼠，分离颈部各动脉，将头端光滑呈鼓锤状的4-0单丝尼龙线由左颈总动脉缓慢插入左颈内动脉颅内段，线栓插入深度由颈内动脉起始处算起约18-22mm，稍感阻力即止。假手术组将线栓插入翼腭动脉。模型成功的标志为: 动物清醒后出现以右前肢为主的偏瘫。术后未出现神经功能缺失体征或24h内死亡者剔除。
1.5 神经行为指标评分 大鼠于术后8h进行神经行为学评分：①提鼠尾离地面约一尺，观察前肢情况。正常大鼠两前肢对称地伸向地面。有右肩内旋，右前肢内收者，评为4分。否则0分。②将大鼠置平滑地面上，分别推左(或右)肩向对侧移动，检查抵抗推力的阻力。正常大鼠双侧阻力明显对称。左肩向右侧移动时，发现阻力下降者，根据下降的程度不同，评为0-3分。③将大鼠两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。正常大鼠两前肢肌张力明显对称。发生右前肢肌张力下降者，根据下降的轻重，评为0-3分。根据以上评分标准，满分为10分，分数越高表明其神经行为障碍就越严重。
1.6 脑梗死范围的测定 于术后24h处死大鼠开颅取脑，将新鲜全脑冠状切面等分为6片，于37℃水浴中10g/L的TTC磷酸缓冲液染色20min后，用FA1004型电子天平称其质量，计算脑梗死范围。脑梗死范围＝(梗死区重量/全脑重量)×100%
1.7 脑组织病理检查 于MCAO 24h 处死大鼠开颅取脑，用200mL/L甲醛将标本固定，将大脑冠状切面等分为6片，取第三脑片梗死侧石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察病理改变。
1.8 统计学处理 采用组间比较t检验。
2 结 果
2.1 DNCC对小鼠断头后喘息时间的影响 阳性对照组、DNCC大、中、小剂量组以及同DNCC大、中、小剂量相当的三个剂量的单组份桂利嗪组均可不同程度的延长小鼠断头后喘息时间，与阴性对照组比较有显著性差异。复方大、中、小剂量相当的三个剂量的单组份参三七提取物与阴性对照组比较无明显差异(表1)。表1 DNCC对小鼠断头后喘息时间的影响(略)
2.2 DNCC对局灶性脑缺血的影响 桂利嗪胶囊和大、中、小剂量的DNCC均可明显缩小局灶性脑缺血大鼠脑梗死范围、改善神经症状，与模型对照组比较有显著性差异。而同大剂量DNCC含等量桂利嗪原料药的单组份桂利嗪组相比，其梗死范围和行为指标评分虽小于模型对照组，但无显著性差异。桂利嗪胶囊组和DNCC大、中、小剂量组有降低局灶性脑缺血大鼠死亡率的趋势，但与模型对照组比较无显著性差异。DNCC各剂量组与桂利嗪胶囊组及单组分桂利嗪组相比无显著性差异(表2)。表2 DNCC对大鼠局灶性脑缺血的影响(略)
2.3 DNCC对局灶性脑缺血大鼠脑组织病理改变的影响 假手术组光镜下组织结构完整，神经细胞膜及核膜清晰，核仁明显(图A)。模型对照组可见神经细胞排列紊乱，神经元数量明显减少，细胞周围间隙增大，可见大小不等的空泡，细胞退行性变明显，细胞核深染、固缩，间质明显水肿(图B)。桂利嗪胶囊组和大剂量DNCC组绝大部分神经元结构清晰，未见明显病变(图C、D)。中剂量和小剂量DNCC组神经元数量略有减少，部分神经元有退行性变，间质有水肿，但明显轻于模型对照组(图E、F)。单组份桂利嗪组神经元退行性变较明显，细胞周围间隙扩大(图G)。图1 DNCC对局灶性脑缺血大鼠脑组织的影响(略)
3 讨 论
小鼠断头后，脑供血中断，脑组织内贮存一定能量，可使断头小鼠维持一段时间的张口喘气，能量耗竭，活动便停止。该模型简单易行，是筛选抗脑缺血药物的一种简易方法。本实验观察到阳性对照药桂利嗪胶囊和DNCC均可延长小鼠断头后的喘息时间，提示DNCC对于缺血性脑损伤有一定的保护作用。单组份桂利嗪组同阴性对照组相比，在统计学上有显著性差异，而单组份参三七提取物则无此作用，提示单组份桂利嗪可能为该复方制剂起效的主要成份。脑缺血发生以后，脑组织血供减少或中断，脑能量代谢发生障碍。由于底物的缺乏和pH的降低导致线粒体内电子转运链的活动停止，从而ATP含量迅速下降，使Na+，K+ATP酶功能障碍，细胞内的Na+含量上升，使得细胞钠、水潴留，导致细胞水肿。此外由于缺血损伤造成血脑屏障的破坏，导致细胞周围间隙的液体增加，进一步加重细胞水肿。缺血严重的组织由于能量供应的缺乏而产生梗死。TTC作为一种水溶性盐，能够同活细胞中线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，使活组织染为深红色，而梗死组织则不染色，故TTC染色是一种简单易行的反映脑组织梗死状态的方法。脑组织缺血性损伤引起神经功能障碍，而神经行为学评分是一种量化神经功能障碍的评定方法，所以其不仅可作为评价模型建立成功与否的标准，而且能够反映缺血损伤的病理生理学的进程。本实验发现DNCC各给药组以及桂利嗪胶囊组均可不同程度的减少缺血引起的细胞水肿，缩小脑梗死范围，改善神经行为学评分，说明DNCC对于局灶性脑缺血损伤具有保护作用。而单组份桂利嗪组同模型组相比无显著性差异，与小鼠断头实验的结果相反，这可能是由于小鼠断头实验是一个生理条件下的药物筛选试验，而大鼠MCAO则是在病理条件下观察药物的抗脑缺血作用，故推测仅靠大剂量的DNCC所含的桂利嗪成份不足以对抗脑缺血损伤。考虑到DNCC含有的其他两种成份比例较小，难以单独对抗缺血性脑损伤，故推测DNCC的抗脑缺血损伤作用可能是各组份共同作用的结果。
综上所述，我们认为DNCC能改善急性脑缺血神经元的损伤，增加细胞的稳定性及存活能力,对局灶性脑缺血损伤具有保护作用。但其抗脑缺血损伤的机理尚待进一步研究证实。
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1.西安交通大学医学院药理学系，陕西西安 710061；
2. 丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司，广东珠海 519020
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