肺组织灌注前后双向电泳的比较
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李圣青 ,赵 峰 ,戚好文 ,张晓君 ,赵 馨,潘 刚 ,吴
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作者简介：李圣青(1970),女(汉族),博士,主治医师.研究方向:急性肺栓塞的病理生理研究和血清学诊断.
摘要：目的 寻找更加有效的双向电泳方法以展示肺组织蛋白。方法 取6只Wistar大鼠随机分为对照组和灌注组，用丙酮/三氯醋酸法提取肺组织蛋白并进行双向电泳分离，将2D胶银染后用ImageScanner扫描仪扫描，采用ImageMaster 2D Elite 3.10软件进行图象分析。结果 对照组2D胶的蛋白点计数为1095±5，灌注组蛋白点计数为1 569±10。在分子质量30-70ku范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他分子质量范围内二者蛋白点计数无显著性差异。在pH值5-8、9-10范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他pH值范围内二者蛋白点计数无显著性差异。结论 生理盐水灌注法可显著减少肺组织中的血液蛋白成分，使得肺组织蛋白可以更好的在2D 胶上展示。
关键词：双向电泳；肺组织；灌注
Comparison of 2Dimensional electrophoresis of pulmonary tissue proteins before and after saline perfusionLi Shengqing, Zhao Feng, Qi Haowen, Zhang Xiaojun, Zhao Xin,Pan Gang, Wu Zhe, Wang Yu, Que Haiping, Liu Shaojun
(1. Department of Respiratory Medicine, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032;
2. Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;
3. Academy of life Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China)
ABSTRACT: Objective To find a better way to display lung tissue proteins by 2dimensional electrophoresis(2DE). Methods Lung tissue was obtained directly or after saline perfusion. Proteins were extracted by acetone/TCA methods and separated by 2DE to identify differently displayed proteins. The silverstained 2DE were scanned with digital ImageScanner and analyzed with ImageMaster 2D Elite 3.10 software. Comparison of protein spots obtained directly or after saline perfusion was carried out in statistical ways. Results The saline perfusion group displayed 1569±10 protein spots on 2DE gels and the control group 1095±5 protein spots. The saline perfusion group displayed more proteins between 30-70ku than the control group, and had no difference with it in the other molecular weight range. The saline perfusion group also displayed more proteins between pH 5-8 and 9-10 than the control group, and had no difference with it in the other pH range. Conclusion The saline perfusion methods can greatly reduce a few families of high abundance proteins(albumin, immunoglobulins) in sera, so the lung tissue proteins can be better displayed on 2DE gels.
KEY WORDS: 2dimensional electrophoresis; lung tissue; perfusion
蛋白质组学是继基因组学之后飞速发展的一个学科。比较蛋白质组学在研究疾病的发生、发展和转归，寻找疾病特异性的诊断指标和药靶方面发挥着越来越重要的作用。双向电泳技术是一种先进的蛋白展示技术，是蛋白质组学的重要研究方法之一。目前，在呼吸系统疾病的研究中，双向电泳技术多用于肺部肿瘤细胞系、肿瘤组织、肺泡灌洗液的研究。但该技术用于展示栓塞肺组织的蛋白仍未见报道，究其原因，主要是海绵样的肺实质中充斥着大量的血液成分。这些血液成分(蛋白)，如血浆白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白和血红蛋白等，在蛋白提取过程中混杂于肺组织蛋白中，由于这些蛋白均为高丰度蛋白，不但会在2D胶上掩盖肺组织蛋白，而且也会使肺组织的低丰度蛋白难以显示。为了克服这一难题，我们希望摸索出一套技术路线，能够利用双向电泳技术更好地展示肺组织蛋白，获得更多的生物学信息。
1 材料与方法
1.1 材料 二硫苏糖醇(DTT)、尿素(Urea)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸(glycine)、琼脂糖(agarose)、甘油(glycerol)、溴酚蓝(bromophenol blue)、3(3胆胺丙基)二甲氨基1丙磺酸(CHAPS)、苯*****(PMSF)、两性电解质(CA)、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉丙烯酰胺(N,Nmethylene bisacrylamide)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、碘乙酰胺(iodoacetamide)、四乙基乙二胺(TEMED)、低分子质量标准蛋白、IPG缓冲液、IPG覆盖液和IPG干胶条(3-10NL和3-10L，18cm)均购自Amersham Pharmacia公司，考马斯亮蓝R250购自Amresco公司，双向电泳所有溶液均用MilliQ水配制。紫外分光光度计UV330购自英国Unicam公司，IPGphorTM等电聚焦仪、Ettan DaltⅡ电泳设备、Hoefor凝胶自动染色仪、ImageScanner扫描仪、ImageMaster 2D Elite 3.10图象分析软件均购自Amersham Pharmacia公司。雄性Wistar大鼠购自解放军军事医学科学院实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 大鼠肺组织的提取 取雄性Wistar大鼠6只，每只体重约300g，随机分为2组，即对照组和灌注组各3只。将灌注组大鼠用10g/L戊巴比妥0.1mL麻醉，分离一侧的颈总静脉和颈总动脉。结扎颈总静脉远端，插入输液管，结扎固定，剪断颈总动脉的同时打开输液器，快速加压输注生理盐水500mL。迅速开胸，取出肺组织，用生理盐水反复冲洗，-80℃冻存。对照组可直接将大鼠麻醉后取肺组织。
1.2.2 肺组织蛋白的提取 采用三氯醋酸/丙酮沉淀法提取肺组织蛋白。首先将肺组织剪碎，然后加入含DTT(2g/L)的100g/L三氯醋酸的丙酮溶液中进行机械匀浆；-20℃沉淀过夜；用含2g/L DTT的预冷丙酮反复洗涤沉淀，最后在通风橱中使丙酮挥发。在沉淀中加入裂解液(9mol/L Urea，40g/L CHAPS，10g/L DTT，5mL/L CA，1mmol/L EDTA，35mg/L PMSF，0.7mg/L抑肽素，0.5mg/L亮肽素)，15℃，40000×g，离心1h，取上清。用Bradford法对上清进行蛋白定量，分装后-80℃保存。
1.2.3 一向等电聚焦 对照组采用18cm pH3-10NL胶条，灌注组采用18cm pH3-10NL胶条。肺组织蛋白1mg(考染检测)与再水合液(8mol/L Urea, 20g/LCHAPS，痕量溴酚蓝，临用前加入20mmol/L DTT和5mL/L IPG Buffer)充分混合，总体积为350μL。一向等电聚焦在IPGphor等电聚焦仪上进行，参数设置为30V 再水合12h；200V，1h；500V，1h；1000V，1h；8000V，逐渐升压30min，最后维持在8000V，总计聚焦功率达到50000伏小时。
1.2.4 胶条平衡 等电聚焦结束后，将胶条先后在平衡液Ⅰ(6mol/L Urea，300mL/L Glycerol，20g/L SDS，50mmol/L TrisHCl，pH8.8，痕量溴酚蓝, 临用前加入2g/L DTT)和平衡液Ⅱ(用前加入25g/L碘乙酰胺, 不加DTT,其余成分同平衡液Ⅰ)中各平衡15min。
1.2.5 二向SDS PAGE电泳 采用Ettan DaltⅡ电泳系统，PAGE胶浓度为14%T, 3%C。参数设置为5W/gel运行30min；然后25W/gel运行4h，直至溴酚蓝至底边约1cm处停止。
1.2.6 硝酸银染色 银染在Hoefor凝胶自动染色仪上进行。固定液(500mL/L无水乙醇，100mL/L冰醋酸)固定1h；更换增敏液(300mL/L无水乙醇，2.5mL/L戊二醛，2g/L硫代硫酸钠和68g/L无水醋酸钠)30min；去离子水洗3次，每次5min；加入25g/L硝酸银溶液(含0.2mL/L甲醛)避光反应20min；加显色液(25g/L无水碳酸钠和0.1mL/L甲醛)3-10min；最后加入终止液(14.6g/L乙二胺四乙酸二钠)，10min后终止反应。以上各步骤在20℃振荡下进行。
1.2.7 扫描和图象分析 分别选取对照组和实验组的2D胶各3张，采用ImageScanner扫描仪，应用ImageLabScan软件，以300bpi分辨率扫描2D胶。用ImageMaster 2D Elite 3.01图象分析软件进行点检测，背景消减，二维校正等，以确定蛋白点的差异。
1.2.8 信息学分析 登陆http://ca.expasy.org/ch2d/网站，检索SWISS2DPAGE数据库，将本实验得到的2D胶与血浆和红细胞的2D胶图谱分别进行比对，采用生物信息学方法确认2D胶上的高丰度蛋白点是何种性质蛋白。
1.2.9 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异显著。
2 结 果
2.1 双向电泳图分析 信息学分析结果提示对照组3张2D胶上的高丰度蛋白点主要为血浆中的白蛋白、转铁蛋白和红细胞的血红蛋白α链和β链成分，由于这些无意义高丰度蛋白的存在，使得真正肺组织的蛋白难以在2D胶上显示。与此形成鲜明对照的是灌注组3张2D胶的上述高丰度蛋白显著减少，从而肺组织的蛋白点相应增加，蛋白点比较锐利(图1)。图1 肺组织的双向电泳图(略)
2.2 蛋白分布特点比较 对照组的蛋白点计数为1095±5，灌注组的蛋白点计数为1569±10。在分子量30-70ku范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他分子量范围内二者蛋白点计数无显著性差异(图2)。图2 不同分子量的肺组织蛋白分布(略)。在pH值5-8和9-10范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他pH值范围内二者蛋白点计数无显著性差异(图3)。图3 不同等电点的肺组织蛋白分布(略)
3 讨 论
肺栓塞的动物模型分为两类：一类是药物引起的肺部弥漫性微血栓；另一类是各种栓子引起的肺部大血管堵塞。我们采用的是第二类肺栓塞动物模型，因为这种模型更接近临床实际情况。实验证明，采用颈静脉插管，生理盐水灌注的方法，可以有效地去除肺组织内的血液成分，使肺组织蛋白能够更好地在2D胶上展示。首先，对照组2D胶上出现的高丰度血液蛋白成分，如：白蛋白、转铁蛋白及红细胞的血红蛋白α链和β链等，在灌注组2D胶上显著减少，相应的增加了肺组织中低丰度蛋白的上样量。其次，灌注组2D胶上的肺组织蛋白成分相应增加，表现为蛋白点计数的提高。对照组的蛋白点计数为1095±5，灌注组的蛋白点计数为1569±10。在分子量30-70ku范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他分子量范围内二者蛋白点计数无显著性差异。在pH值5-8和9-10范围内，灌注组的蛋白点计数显著高于对照组(P<0.01)，在其他pH范围内二者蛋白点计数无显著性差异。
需要注意的是在对肺组织进行生理盐水灌注时，需要严格控制生理盐水的量和灌注时间。生理盐水量不足，使血液成分得不到有效置换；灌注时间过长，会使肺组织蛋白分解。本实验每只大鼠的生理盐水用量为500mL，采用加压输注的方法，使灌注时间控制在5min内，既可有效去除血液成分，也可防止蛋白分解。
参考文献：
[1]Sam H. Disease proteomics . Nature, 2003, 422(2): 226232.
[2]Eric P, Philippe IHB, Zhu H, et al. Protein analysis on a proteomic scale . Nature, 2003, 422(2):208215.
[3]de Hoog CL, Mann M. Proteomics . Annu Rev Genomics Hum Genet, 2004, 5(2):267293.
[4]Andrej S, Robert G, Thomas E, et al. From words to literature in structural proteomics . Nature, 2003, 422(2):216225.
[5]李圣青,张艰,戚好文,等.小鼠肺栓塞模型的诱导及比较 . 第四军医大学学报, 2004, 24(9):813814.
[6]陈永利, 张敬霞, 袁志明, 等. 实验性急性血栓性肺栓塞动物模型的建立 . 天津医科大学学报, 2003,9(1):46.
(1. 第四军医大学西京医院呼吸科，陕西西安 710033；
2. 解放军军事医学科学院三所一室， 北京 100850；
3. 吉林大学生命科学院，吉林长春 130021)
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