骨康宁治疗实验性大鼠骨质疏松的影像与病理对照研究
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于伟利 ,王世捷 ,郭 雄 ,李润明 ,赵丽华 ,黄 芳 ,
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作者简介：于伟利(1958)，男(汉族)，学士，副主任医师，从事影像学诊断
摘要：目的 探讨中药骨康宁治疗骨质疏松大鼠的效果。方法 5-6月龄雌性SD大鼠，维甲酸复制骨质疏松模型后，给予中药骨康宁治疗。用影像学、骨病理组织学、形态计量学、骨生物力学等实验技术，观察骨康宁的治疗效果。结果 经骨康宁治疗后，骨质疏松大鼠的平均骨小梁数、平均骨小梁宽、骨皮质指数、股骨骨密度、股骨的最大变形能力等增加，并明显高于骨质疏松组(P<0.05)。结论 骨康宁对维甲酸诱导的大鼠骨质疏松有一定的治疗作用。
关键词：骨质疏松；骨康宁；维甲酸；影像
The effect of Gukangning capsule on the osteoporotic model of the rats induced by retinoic acidYu Weili, Wang Shijie, Guo Xiong, Li Runming,Zhao Lihua, Huang Fang, Chen Kai, Guo Xuan
(1. Department of Imaging Center, Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004;
2. Endemic Institute, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710061;
3. Department of Laboratory Examination, Second Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)
ABSTRACT: Objective To understand the effect of Gukangning capsule on the osteoporotic model of the rats. Methods Female SD rats, 5-6 months after birth, were chosen to duplicate the osteoporotic model induced by retinoic acid and treated with Gukangning capsule. The effect of Gukangning capsule on osteoporosis was evaluated by radiology, morphometry, BMD and biomechanics of bone. Results After oral administration of Gukangning capsule, the mean trabecular plate density, the mean trabecular plate thickness and the trabecular bone volume, BMD and maximum strain of the rats, were significantly increased more than that of the osteoporotic model (P<0.05). Conclusion To some extent, Gukangning capsule has a therapeutic effect on the osteoporotic model of the rats induced by retinoic acid.
KEY WORDS: osteoporosis; Gukangning capsule; retinoic acid; image
以骨量减少为主要特征，骨组织的显微结构发生改变，并伴随骨质脆性增加和骨折危险度升高的一类全身性骨骼疾病称为骨质疏松症。随着老年人群的迅速增长，骨质疏松症已成为一个引起全世界关注的公共健康问题。骨康宁含有补骨脂、骨碎补等复方中药，具有壮肾健骨、健脾益气、活血通络等功效。本实验以大鼠为实验对象，用维甲酸复制骨质疏松模型，骨康宁治疗后采用影像学、骨病理组织学、形态计量学等方法，观察其对大鼠骨质疏松的治疗效果。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组 选用45 只雌性SD大鼠，5-6月龄(本院实验动物中心提供)，按体重随机分为正常对照组(正常组，10只)和骨质疏松模型组(35只)。以维甲酸80mg/(kg·d)(上海第六制药厂)灌胃15d，诱导骨质疏松。骨质疏松模型组大鼠处死7只证实骨质疏松模型复制成功后，剩余大鼠再随机分为骨质疏松模型组(9只)、骨康宁治疗组(骨康宁组，10只)和雌激素治疗阳性对照组(9只)3组。正常组大鼠继续观察。骨质疏松模型组给予常规饲料、蒸馏水；骨康宁组给予0.8g/(kg·d)骨康宁混悬液，1次/d灌胃；雌激素组腹腔注射苯甲酸雌二醇50μg/只，每周3次。治疗期为60d。
1.2 取材 实验60d时，各组以200g/L苯巴比妥溶液(5mL/kg)麻醉下处死动物。取双后肢及胸腰椎骨，40g/L多聚甲醛固定。
1.3 钼靶摄影 随机取每组实验大鼠一侧胫骨及股骨，在同一电压电流下行钼靶摄影。
1.4 骨病理组织学观察 取股骨上段中1/2段，经40g/L多聚甲醛固定，80g/L的中性EDTA脱钙液脱钙40d，常规石蜡包埋，用90g/L的多聚赖氨酸处理载玻片，切片，片厚6μm，伊红苏木素染色(HE)。
1.5 骨组织形态计量学 股骨的石蜡切片经HE染色后应用半自动彩色图像分析系统分析测量。以关节软骨下1mm以外的松质骨区域，每张切片测量3个视野(放大倍数×40)，取平均值，测量平均骨小梁密度、平均骨小梁宽度、骨小梁面积百分比、平均骨小梁间距；测量股骨中段皮质骨面积、皮质骨面积百分比、骨髓腔面积百分比。
1.6 骨矿密度(BMD)测定 用QDR2000型HOLOJAC双光子骨密度仪测量四肢骨与胸腰部椎体骨矿密度，变异系数≤ 3 %。测量时，将各离体骨按一定顺序放入有机玻璃盒内，注入蒸馏水(以刚好盖过所有骨面为宜)进行扫描。使用Regional high resolution QDR 4500小动物分析软件。
1.7 骨生物力学测定 右股骨用微机控制电子万能试验机进行三点力学试验，观察最大应力。当外力作用于骨时，骨以形变产生内部的阻抗来抗衡外力，即骨产生的应力，用最大负荷力表示，单位为g/cm2。应变是指骨在外力作用下的变形，大小等于骨受力后长度的变化量，用最大负荷表示，单位为cm。测量时，调整两个约束支架相距20mm，将两个大鼠股骨比较均匀的部位放在两个约束支架上，股骨的短轴与垂直方向平行，逐级加压直至屈服，读取导致屈服的负荷的数据。待测试件用生理盐水保持湿润，荷载测量精度为0.1N(牛顿)，变形测量精度为0.001mm。
1.8 血清降钙素(CT)质量浓度测定 应用放免分析测定法。
1.9 统计学处理 所有数据输入计算机，用SPSS 10.0统计软件进行t检验和方差分析，结果以均值±标准差(±s)表示，检验水准α＝0.05，P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 维甲酸诱导大鼠骨质疏松模型的结果
2.1.1 骨病理组织学 光镜下皮质骨变薄，骨髓腔扩大，骨纹理变稀、变细；松质骨骨小梁密度降低，骨小梁面积百分比减少；皮质骨面积百分比降低，说明松质骨、密质骨骨量均减少，发生了骨质疏松(图1)。图1 实验各组骨小梁(略)
2.1.2 钼靶X线片在解剖镜下观察的结果 正常对照组10例，左胫骨及股骨骨皮质骨密度均匀致密，骨髓腔不宽，松质骨骨纹理粗细均匀(图2A)。骨质疏松模型组9例，左胫骨及股骨骨皮质菲薄，部分吸收，骨髓腔增宽，松质骨骨纹理稀疏、变细(图2B)。骨康宁组10例，左胫骨及股骨骨皮质骨密度不均匀，变薄有分层，骨髓腔稍增宽，松质骨骨纹理稀疏而粗细不均(图2C)。雌激素组9例，左胫骨及股骨骨皮质变薄，骨髓腔稍增宽，松质骨骨纹理稀疏而粗细不均(图2D)。图2 各组大鼠胫骨及股骨钼靶X线观察结果(略)
2.2 骨康宁治疗骨质疏松的效果
2.2.1 光镜下骨病理组织学 与治疗前相比，治疗后骨康宁组和雌激素组大鼠股骨下端松质骨骨小梁数增多，骨小梁增宽，骨小梁间隙缩小，而骨质疏松模型组骨小梁数和骨小梁间隙变化不明显(图1略)。
2.2.2 骨组织形态计量学指标 松质骨：治疗前与治疗后相比，正常组、骨康宁组和雌激素组股骨下端松质骨的平均骨小梁数、骨小梁宽度和骨小梁面积百分比均显著增加，而骨小梁间隙显著缩小。治疗60d后，骨康宁组平均骨小梁数、骨小梁宽度、骨小梁面积百分比与雌激素组、正常组比较无显著性差异，但均高于骨质疏松模型组(表1)。表1 治疗后60d各组大鼠松质骨形态学测量结果(略)
皮质骨：治疗后，骨康宁组和雌激素组的皮质骨面积、皮质骨面积百分比增加，骨髓腔面积百分比减少，与正常组相比无显著性差异。骨康宁组的骨髓腔面积百分比与正常组和雌激素组间无显著性差异，但低于骨质疏松模型组(表2)。表2 治疗60d后各组皮质骨组织形态测量比较(略)
2.2.3 钼靶X线(解剖镜下) 与骨质疏松模型组相比，治疗后骨康宁组和雌激素组大鼠胫骨和股骨骨皮质骨密度增高，有分层，骨髓腔缩小，松质骨骨纹理粗细不均；无措施组大鼠胫骨X线表现与治疗前相比，无明显变化。
2.2.4 骨密度 股骨骨密度测试结果表明，治疗后骨康宁组显著高于骨质疏松模型组，与正常对照组及雌激素组相比无显著性差异。椎骨骨密度测试结果表明，治疗后骨康宁组与正常对照组及雌激素组相比，无显著性差异，且均高于骨质疏松模型组(表3)。表3 各组大鼠骨密度检测结果(略)
2.2.5 骨生物力学 药物治疗2个月后，大鼠左股骨结构力学及材料力学的变化如表4。最大应力为骨材料力学特性，本实验表明，骨康宁治疗组与骨质疏松模型组相比较有显著性差异(P<0.05)，与雌激素组相比较无显著性差异；最大桡度为骨结构力学特性，骨康宁治疗组与无措施组相比较，雌激素组与模型组比较，均有显著性差异(P<0.05)。本次实验表明，中药骨康宁可明显提高大鼠左股骨骨结构力学及材料力学特性。
2.2.6 血清降钙素(CT) 各组大鼠喂养60d后，骨康宁治疗组血清降钙素质量浓度与骨质疏松模型组相比较有显著性差异(P<0.05)，骨康宁组与正常对照组及雌激素组相比无显著性差异(P>0.05，表4)。表4 各组大鼠骨生物力学和血清降钙素(CT)测量结果(略)
3 讨 论
骨质疏松模型的方法较多，由于维甲酸诱导具有操作简单、成功率高和骨质疏松表现典型、易于进行给药观察等优点而被较广泛使用。目前认为维甲酸主要是通过激活破骨细胞的分化、增殖，损伤大鼠卵巢，雌激素分泌减少，雌激素对破骨细胞的抑制作用减弱，促进骨吸收作用而诱导大鼠骨质疏松。本实验大鼠维甲酸灌胃15d后，股骨松质骨骨小梁密度降低、稀疏，小梁面积百分比减少，骨髓腔扩大；皮质骨厚度呈减低趋势，皮质骨面积百分比降低，表明松质骨、皮质骨骨量减少，大鼠骨质疏松模型复制成功。
目前，骨质疏松症的常用诊断方法有X线照相法、X线吸收法、光子吸收法、骨组织形态计量学方法、超声诊断法、骨生物力学法等，它们各自有优缺点。一般的X线片，只有在骨量减少达到骨总量的30%-40%时才能显示骨质疏松的征象，因此单纯X线检查对早期诊断骨质疏松的意义不大，但是当骨质疏松发展到一定程度时，根据目测脊柱形态、骨质密度、皮质厚薄及骨小梁的形态等，仍可做出诊断依据。骨密度的测定常被用于评定骨脆性和对骨折危险性进行预测，但大量的动物实验和临床研究的结果表明，单纯骨矿物盐含量的增加，骨质量并不一定相应的增加，有时反而降低。骨生物力学是生物力学的分支，它以工程力学的理论为基础，研究骨组织在外界作用下的力学特性和骨在受力后的生物学效应，是对骨质量进行评定的一种较可靠方法。因此，在骨质疏松的诊断中应采用多种方法综合判断。本研究采用多种方法，观察骨康宁治疗维甲酸诱导骨质疏松的效果，结果显示：X线检查表现为骨康宁组大鼠骨皮质较骨质疏松模型组增厚，骨小梁增多；骨组织计量学分析显示骨康宁组平均骨小梁数、骨小梁面积百分比和皮质骨面积百分比显著高于骨质疏松模型组，而平均骨小梁间隙和髓腔面积百分比显著低于骨质疏松模型组；股骨和椎骨骨密度测试结果表明，骨康宁组显著高于无措施组，而与正常对照组及雌激素组相比无显著性差异；骨生物力学结果提示中药骨康宁可明显提高大鼠左股骨骨结构力学及材料力学特性，客观地反映了中药骨康宁治疗维甲酸诱导骨质疏松的效果。
降钙素(CT)由甲状腺C细胞(滤泡旁细胞)产生，降钙素对骨的作用是抑制破骨细胞的数量和活性，直接抑制骨质吸收。降钙素可直接作用于破骨细胞受体，使细胞内Ca2+转入线粒体，抑制破骨细胞的活性，还能抑制大单核细胞转变为破骨细胞，从而减少骨吸收。降钙素的这种抑制骨吸收的作用，在整体动物和骨细胞培养实验中均已得到证实。从本实验结果可知，骨康宁能明显增加大鼠血清降钙素的质量浓度，说明中药骨康宁能通过增加血清降钙素质量浓度而发挥抑制骨吸收的作用。
综合上述，本研究采用影像与病理对照研究，观察骨康宁治疗维甲酸诱导骨质疏松的效果，结果表明骨康宁对大鼠骨质疏松有一定的防治作用，其分子生物机制将有待于进一步的研究。
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(西安交通大学医学院：1. 第二附属医院放射科，陕西西安 710004；
2. 地方病研究所，陕西西安 710061；
3.第二附属医院检验科，陕西西安 710004)
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