应用特异性噬菌体抗体克隆和筛选新的大肠癌抗原基因
http://www.100md.com
李艳雯,李官成
大肠癌;cDNA文库;抗原;噬菌体人抗体;基因克隆
 |
| 第1页 |
参见附件(372KB，4页)。
作者简介：李艳雯(1979)，女(汉族)，湖南衡阳人，硕士生，现工作于南华大学附一医院.
摘要：目的 构建人大肠癌细胞cDNA表达文库，用抗人大肠癌噬菌体抗体CH209筛选新的大肠癌抗原基因。方法 抽提人大肠癌细胞HRT18的总RNA后分离mRNA，利用SMART(Switching Mechanism at 5th end of RNA Transcript)技术合成cDNA，与λTripIEx2载体连接包装成cDNA文库。测定原始文库的滴度和文库重组率，鉴定插入片段的大小，测定扩增文库库容量并鉴定CH209筛选的阳性克隆。结果 原始文库滴度为6.5×106pfu/mL，重组率为97%；插入片段的大小介于0.5-2.0kb之间；扩增文库滴度为1.1×109pfu/mL，筛选后获得 10个阳性克隆，代表10个抗原基因，其中5个与已知基因高度同源，3个与已知基因部分同源，2个是新基因。结论 成功构建了人大肠癌细胞的cDNA文库；用CH209筛选得到10个大肠癌相关抗原基因，有2个是新基因。
关键词：大肠癌；cDNA文库；抗原；噬菌体人抗体；基因克隆
Cloning and screening novel gene with phage fusion antibodyLi Yanwen, Li Guancheng
(Cancer Research Institute, Xiangya School of Medicine,Central South
University, Changsha 410078, China)
ABSTRACT: Objective The cDNA expression library, which was constructed with human colorectal cancer cell HRT18, was screened with the phage antibody CH209 in order to find novel antigen genes of colorectal carcinoma. Methods Total RNA was extracted from cell HRT18 and mRNA was isolated from total RNA and then double strand cDNA was synthesized by SMART technique. cDNA was ligated into λ TripIEX2 vector and then was packaged into λ phage in vitro. The primary library was titrated and the percentage of recombinant clones were determined. The length of cDNA inserts was tested for ligation efficiency. The library was screened with phage fusion antibody CH209 and the sequences of the reacted clones were determined. Results The primary library consisted of 6.5×106 pfu/mL, and the percentage of recombinant clones was 97%. The length of cDNA inserts was 0.5-2.0kb. The titer of the amplified cDNA library was 1.1×109 pfu/mL. Ten positive clones were obtained and derived from ten different genes. Five of these genes were high homologous to genes known in GenBank, and there were also three genes with low homology to genes known in GenBank. The remainder two genes might be novel genes by matching in GenBank with BLAST software. Conclusion The quality of the constructed cDNA library from human CRC cell HRT18 is excellent. Ten positive clones were obtained and two of them may be novel genes.
KEY WORDS: colorectal cancer; cDNA library; antigen; phage fusion antibody; gene cloning
近年来国内外利用构建和筛选癌组织或细胞的cDNA文库的方法克隆了许多肿瘤相关基因和肿瘤抗原基因。然而到目前为止，关于大肠癌肿瘤抗原的筛选及鉴定研究工作国外仅有很少的几篇文献报道，国内尚未见报道。我们在多年的研究中已获得了抗大肠癌单链抗体，即CH209等。该抗体为特异性的人源基因工程抗体，免疫组化和ELISA的结果都表明能与大肠癌细胞有特异性反应，这为寻找大肠癌特异性的抗原基因奠定了基础。我们采用SMART(Switching Mechanism at 5th end of RNA Transcript)技术，构建了大肠癌细胞HRT18的cDNA文库，并用抗大肠癌单链抗体CH209对文库进行免疫学筛选及鉴定大肠癌及其相关肿瘤抗原，拟为大肠癌肿瘤疫苗的研制提供候选抗原，也有可能为大肠癌早期诊断提供血清学分子标志物。
1 材料与方法
1.1 材料 总RNA抽提试剂TRIzol为Invitrogen公司产品，SMARTTMcDNA文库构建试剂盒购自Clotech公司，mRNA纯化试剂盒及Packagen Lambda DNA Packing system均购自Promega公司。RPMI1640细胞培养基为华美公司产品，小牛血清购自杭州四季青公司，琼脂糖和细菌培养基均为Gibco/BRL公司产品，余为常规试剂。HRT18人大肠癌细胞株来源于人直肠肛门腺癌组织，为本室保存。采用λTripIEX2载体及大肠杆菌XL1Blue。硝酸纤维素膜购自浙江台洲四甲生化塑料制品厂。抗大肠癌噬菌体人抗体CH209为本室制备。HRP标记的羊抗M13单克隆抗体(HRPantiM13)购自Pharmacia Biotech公司。λTripIEx2插入子筛选引物：5′端引物 5′CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT3′，3′端引物 5′ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC3′。Agarose Gel DNA Purification Kit为上海生工生物工程公司产品。
1.2 大肠癌细胞HRT18 mRNA的提取 人大肠癌细胞株HRT18总RNA抽提按照TRIzol试剂操作说明进行，按每107个细胞加入1mL TRIzol混匀，氯仿抽提、乙醇沉淀和室温干燥后，总RNA溶于无RNase的去离子水中，经紫外分光光度计测定其A260，A280吸光度值鉴定纯度，以浓度为11g/L琼脂糖凝胶电泳证实其完整性后，65℃加热10min后，加入生物素标记的Oligo(dT)探针及可结合生物素的磁珠(SMPMAS)与mRNA杂交形成杂交体，磁性吸附将杂交体从总RNA中分离，经洗脱后溶于无RNase的去离子水中，所得mRNA用于合成
cDNA。
1.3 cDNA的合成及酶切 以纯化的mRNA为模板，用含有SfiⅠ酶切位点的SMART Ⅲ寡核苷酸和CDSⅢ/3′PCR引物合成cDNA第一链，再以CDSⅢ/3′PCR引物和5′PCR引物经LDPCR扩增合成双链cDNA。双链cDNA 经SfiⅠ酶切后，Chroma spin400凝胶过滤柱对cDNA进行凝胶过滤层析，分步收集样品，合并较大的cDNA片段。
1.4 cDNA的包装及文库的扩增 将cDNA与载体λTripIEX2按1∶1比例连接，采用Packagen Lambda DNA Packing system(Promega公司)试剂盒进行包装形成噬菌体颗粒。培养XL1Blue宿主菌，用包装产物感染宿主菌，铺于琼脂平板，根据噬斑数计算文库的滴度。按照文库的滴度，继续感染宿主菌，以扩增文库。在扩增的文库加入二甲基亚砜，使其体积分数为7%，于-70℃保存。
1.5 文库的鉴定 取扩增后的文库铺平板，同时随机挑取40个噬菌斑，用λTripIEX2插入子筛选引物，通过LDPCR扩增插入cDNA片段，扩增产物在10g/L琼脂糖凝胶电泳中鉴定插入cDNA片段的大小。
1.6 cDNA文库的筛选 选用抗大肠癌噬菌体人抗体CH209对cDNA文库进行免疫学筛选，第一轮筛选将重组子转染大肠杆菌按104个克隆数铺LB平皿，42℃温育4h后，将经异丙基βD硫代半糖苷(IsopropylβDThiogalactopyranoside, IPTG)处理的硝酸纤维素膜印膜于噬菌斑上诱导蛋白质表达。硝酸纤维素膜封闭后与一抗CH209 4℃过夜，洗膜后与1∶2000的HRP偶联的抗M13单克隆抗体在室温下缓慢摇动2h，洗膜后在 DAB溶液中进行显色反应。所获阳性克隆挑出，保存于适量缓冲液中。第二轮筛选前先测定第一轮筛选所获阳性克隆的滴度，按照其滴度感染宿主菌，铺于平板中，筛选方法同第一轮筛选。不同于第一轮筛选的是第二轮筛选的目的是要排除假阳性。所获阳性克隆经第三轮亚克隆，直至得到一致的免疫阳性重组噬菌体。
1.7 核苷酸序列测定及其生物信息学分析 阳性克隆PCR产物以PCR产物纯化试剂盒纯化后，交由上海博亚公司采用ABI377型DNA测序仪进行序列测定,引物序列为5′端引物序列：5′TCCGAGATCTGGACGAGC3′，3′端引物序列为： 5′TAATACGACTCACTATAGGG 3′。所获克隆的DNA序列在美国国立卫生研究院提供的核苷酸数据库和蛋白质数据库中分析。
2 结 果
2.1 总RNA的抽提和mRNA的纯化 采用TRIzol试剂快速抽提HRT18细胞的总RNA，紫外分光光度计测定其A260/A280为1.91，28S和18S条带清晰，约呈2∶1关系，证明总RNA质量好(图1人大肠癌细胞HRT18的总RNA鉴定(略))。使用磁性吸附法分离mRNA，经PCR扩增检测GAPDH无特异条带，说明RNA无污染。
2.2 cDNA的克隆及文库的构建 重组噬菌体经体外包装后转染大肠杆菌XL1Blue，经IPTG和XGal的蓝白筛选，测定文库滴度为6.5×106pfu/mL，重组率为97%。
2.3 原始文库的扩增及鉴定 原始文库扩增后，测定文库滴度为1.1×109pfu/mL，随机挑取40个克隆经PCR法鉴定插入片段，插入片段介于0.5-2.0kb之间，平均长度为1.1kb(图2 cDNA插入片段的PCR鉴定(略))。
2.4 第一轮噬菌体抗体筛选 cDNA文库经扩增后，用噬菌体人抗体CH209进行筛选。第一轮共对107个重组子进行筛选，共筛选出109个阳性反应克隆，阳性反应噬菌斑如图3所示。
2.5 第二轮和第三轮筛选 第一轮筛选得到的109个阳性克隆，测定其噬菌体混合液的滴度，根据测定结果计算第二轮筛选所需的噬菌体混合液的量。经第二轮筛选，共获得21个阳性反应克隆，所挑取的阳性克隆基本上为单克隆。分别测定这些阳性克隆的混合液的滴度，根据测定结果进行第三轮筛选，得到一致的免疫阳性重组噬菌体，阳性反应结果如图4所示。最终共筛选得到10个阳性反应克隆。图3 第一轮阳性噬菌斑(略)图4 第三轮筛选的阳性反应噬菌斑(略)
2.6 阳性克隆的核苷酸序列测定及同源性分析 阳性克隆经PCR扩增出插入片段，测定此插入片段的核苷酸序列。采用序列分析软件BLAST与NCBI的GenBank数据库中已知基因进行各插入片段序列的同源性比较、分析。结果显示，10个阳性克隆分别代表了10个独立的cDNA片段，分别命名为CRCL1-10(如表 1所示)。这10个抗原基因中有5个与已知基因有较高同源性，经测序分析并在GenBank中进行同源性比较,这10个阳性克隆分别代表10个独立的cDNA插入片段(抗原基因)。其中有5个基因与GenBank中已知基因有较高同源性,如核蛋白L9(RPL9)和核蛋白L19(RPL19)、组蛋白H2A家族的Z(H2AFZ)、转录子1(HMGN3)、ringbox protein 1(RBX1)。而另外5个基因在GenBank序列数据库中分析与已知基因部分同源，其中CRCL9和CRCL10的DNA片段的两端均有数十个碱基与已知基因不匹配，考虑可能是新的基因或EST。另3个基因经综合分析，考虑为已知基因的可能性更大。为此已对前两个基因申请了登陆号，分别为AY597415，AY597416，进一步的确证工作正在进行中。表1 阳性克隆cDNA插入片段的长度(略)
3 讨 论
从20世纪70年代开始，由于限制性内切酶的发现以及质粒等载体的应用，推动了DNA重组技术的发展。构建cDNA文库并从中筛选目的基因是一种非常有效的寻找未知基因的方法。它便于基因的克隆和大量表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
本研究所采用的构建cDNA文库的方法主要优点在于：①提高cDNA文库中所含全长cDNA的比例。我们采用SMART技术，以Oligo(dT)引物逆转录合成cDNA第一链，同时以一段独特的SMART Ⅲ Oligo作为mRNA的5′端延伸的模板，进而以此两个序列为引物进行LDPCR(longdistance PCR)合成双链cDNA，经酶切后定向克隆到合适的载体中。这一技术有利于提高文库全长cDNA比例，结合LDPCR的特点，可构建高质量的cDNA文库；②合成的双链cDNA，经SfiⅠ(ⅠA和ⅠB)酶切后，连接到经SfiⅠ酶切的λTripIEx2的左右臂，从而实现cDNA的简便、快速的定向克隆；③所采用的λTripIEX2载体含2个翻译起始位点和一个滑动位点，重组于λTripIEX2的噬菌体的外源cDNA若插入方向正确，读框无误，可用于进一步筛选。
我们成功构建了人大肠癌细胞株HRT18文库，原始文库6.5×106个克隆，插入片段平均1.1kb，文库扩增后滴度达到1.1×109pfu/mL。CH209为我室制备的抗大肠癌噬菌体人单链抗体，ELISA和免疫组织化学鉴定，结果显示对人大肠癌细胞和组织有较好的特异性反应。用大肠癌细胞构建的cDNA表达文库，包括了HRT18细胞上所有的肿瘤抗原cDNA，而且HRT18细胞也是用作筛选噬菌体人抗体库的靶细胞抗原，与大肠癌特异性噬菌体人抗体有强烈的ELISA反应。因此，用这些特异性噬菌体人抗体筛选HRT18细胞构建的cDNA表达文库，更易得到肿瘤抗原基因。以抗大肠癌噬菌体人单链抗体CH209进行反复筛选,共得到10个阳性克隆,经测序分析并在GenBank中进行同源性比较,这10个阳性克隆分别代表10个独立的cDNA插入片段(抗原基因)。其中有5个基因与GenBank中已知基因有较高同源性,如核蛋白L9(RPL9)和核蛋白L19(RPL19)、组蛋白H2A家族的Z(H2AFZ)、转录子1( HMGN3) 、ringbox protein 1 (RBX1)。核糖体蛋白是催化蛋白合成的细胞器，它包括40S和60S两个亚单位。RPL9和RPL19基因编码的核糖体蛋白都是60S亚单位的组成部分，定位于胞浆中，都有多个假基因分布于整个基因组中。不同的是RPL9属于核糖体蛋白L6P家族，而RPL19属于核糖体蛋白L19E家族。核糖体蛋白家族与肿瘤的关系是近些年才开始受到重视的，如Uemura等检测肝细胞癌患者的血清，发现有20%患者含有RPL30的抗体。该抗原的表达虽然可能不是肝细胞癌非特异性的，但患者血清中的抗体滴度随着病程进展升高，进而对诊断将会有较大的帮助。并且RPL30在前列腺癌也有过表达。而对RPL19的研究甚少，最近 Dressman的研究表明RPL19在乳腺癌也有过表达。还没有RPL9与肿瘤的关系的相关报道。H2AFZ是组蛋白家族成员。该基因编码的是组蛋白H2A家族的一个独立复制部分，它显著的区别于该家族的其他成员。研究表明该基因编码的蛋白是哺乳动物胚胎发育所必须的，并且缺少该蛋白将导致胚胎死亡。此外，还有五个基因与已知基因相比有数十个左右碱基不同，其中三个基因经综合分析，考虑为已知基因的可能性更大，而有两个基因很有可能是新基因。它们与大肠癌的相关性以及在肿瘤的发生发展中起着什么作用，有待于进一步的研究。
参考文献：
[1]Numahata K, Satoh M, Handa K, et al. SialosylLe (x) expression defines invasive and metastatic properties of bladder carcinoma . Cancer, 2002,94(3):673685.
[2]Roseberg SA. Progresses in human tumor immunology and immunotherapy . Nature, 2001,411(6835):380384.
[3]Gulley J, Chen AP, Dahut W, et al. Phase I study of a vaccine using recombinant vaccinia virus expressing PSA (rVPSA) in patients with metastatic androgenindependent prostate cancer . Prostate, 2002, 53(2):109117.
[4]Okada H, Attanucci J, GiezemanSmits KM, et al. Immunization with an antigen identified by cytokine tumor vaccineassisted SEREX (CAS) suppressed growth of RAT 9L glioma in vivo . Cancer Res,2001,61(6): 2625
2631.
[5]朱建高，李官成，孙去病，等. 全人源化抗结肠癌单链抗体基因的克隆和表达 . 生物工程学报,2001,17(5):526528.
[6] 朱建高，李官成，孙去病,等. 抗大肠癌噬菌体单链抗体的初步鉴定及序列分析 . 湖南医科大学学报, 2002, 27(2):9598.
[7] Uemura M, Nouso K, Kobayashi Y, et al. Identification of the antigens predominantly reacted with serum from patients with hepatocellular carcinoma . Cancer, 2003, 97(10):24742479.
[8]Vaarala MH, Porvari KS, Kyllonen AP, et al. Several genes encoding ribosomal proteins are overexpressed in prostatecancercell lines: confirmation of L7a and L37 overexpression in prostatecancer tissue samples . Int J Cancer,1998,78(1):2732.
[9]Dressman MA, Baras A, Malinowski R, et al. Gene expression profiling detects gene amplification and differentiates tumor types in breast cancer . Cancer Res, 2003,63(9):21942199.
[10]Faast R, Thonglairoam V, Schulz TC, et al. Histone variant H2A.Z is required for early mammalian development . Curr Biol,2001, 11(15): 11831187.
(中南大学湘雅医学院肿瘤研究所，湖南长沙 410078)
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(372KB，4页)。