游离脂肪酸对大鼠胰岛细胞体外分泌功能的影响
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惠晓丽 ,王惠芳 ,刘惊涛 ,刘靖芳 ,徐 利
游离脂肪酸;软脂酸;油酸;胰岛细胞;葡萄糖刺激的胰岛素分泌
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参见附件(266KB，4页)。
作者简介：惠晓丽(1976)，女(汉族)，硕士
摘要：目的 探讨饱和脂肪酸软脂酸和单不饱和脂肪酸油酸对大鼠胰岛细胞体外分泌胰岛素功能的影响。方法 体外分离大鼠胰岛细胞，分为：①浓度梯度组，将0.125、0.25、0.5mmol/L软脂酸(PA)和油酸(OA)分别与胰岛细胞共培养48h；②时间梯度组，将0.25mmol/L软脂酸、油酸及二者的混合物与胰岛细胞共培养24、48、72h，进行葡萄糖刺激胰岛素释放试验，放射免疫法检测培养液中胰岛素浓度。结果 ①浓度梯度组，不同浓度PA和OA组葡萄糖刺激后胰岛素分泌水平均明显减少，浓度越高胰岛素分泌越少，高浓度时(0.5mmol/L)，高糖刺激下OA组胰岛素分泌高于PA组；②时间梯度组，PA、OA及混合组，葡萄糖刺激后胰岛素分泌水平均明显减少，随时间延长，胰岛素分泌逐渐减低；相同时间段，各组胰岛素分泌无差异(P>0.05)。结论 PA和OA对大鼠胰岛细胞分泌功能均有一定的抑制作用，呈剂量依赖性，PA抑制程度呈时间依赖性；高浓度时PA抑制程度大于OA；OA对PA诱导的胰岛细胞分泌功能损伤无保护及协同效应。
关键词：游离脂肪酸；软脂酸；油酸；胰岛细胞；葡萄糖刺激的胰岛素分泌
Effects of free fatty acids on the insulin secreting function of rat pancreatic isletsHui Xiaoli1, Wang Huifang1, Liu Jingtao2, Liu Jingfang1, Xu Li1
(1. Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061;
2. Department of Nuclear Medicine, No.451 Hospital of PLA, Xian 710054, China)
ABSTRACT: Objective To study the effects of saturated free fatty acids palmitic acid (PA) and monounsaturated free fatty acids oleic acid (OA) on the insulin secreting function of rat pancreatic islets. Methods Isolating and culturing the rat pancreatic islets in vitro, ① the concentration group exposed the islets to PA, OA at different concentrations(0.125, 0.25, 0.5mmol/L) for 48h; ② the time group exposed the islets to 0.25mmol/L PA, OA and a kind of mixture of them(both concentrations are 0.25mmol/L) for 24h, 48h, 72h, then made a glucosestimulated insulin secretion test respectively, examined insulin level in every group by radioimmunoassay after stimulated by low glucose and high glucose and compare them. Results ① The concentration group insulin level in every group of PA or OA after stimulated by low glucose and high glucose was reduced significantly, and the higher concentration, the lower insulin level. At high concentration
(0.5mmol/L ), insulin level of OA group after stimulated by high glucose is higher than that of PA group; ② The time group insulin level in every group of PA, OA and the mixture group after stimulated by low glucose and high glucose was reduced significantly. With the prolong of duration, insulin secretion was reduced gradually. There wasnt significant difference in the insulin level of every group at the same duration. Conclusion Both PA and OA exert inhibition on the insulin secretion function of rat pancreatic islets, and the degree of impact indicats a concentrationdependant fashion. The effect made by PA indicats a timedependant fashion. OA cannt protect islets from PAinduced toxicity and they dont have synergistic effects on impairing the secreting function of islets.
KEY WORDS: free fatty acids; palmitic acid; oleic acid; pancreatic islets; glucosestimulated insulin secretion
肥胖是2 型糖尿病的易患因素，在肥胖和2 型糖尿病中常有游离脂肪酸(free fatty acids, FFA)的升高。研究发现,游离脂肪酸的升高可能是2型糖尿病发生的始动因素，高脂环境下胰岛β细胞功能障碍与2型糖尿病的发病密切相关。体内实验证明，FFA长期升高可损伤胰岛β细胞功能，抑制胰岛素分泌，造成胰岛素分泌量减少 。本实验以原代培养的大鼠胰岛细胞为模型，研究饱和脂肪酸软脂酸和单不饱和脂肪酸油酸对体外培养大鼠胰岛细胞的分泌功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 胶原酶Ⅴ、软脂酸、油酸均为Sigma公司产品，Ficoll 400购自 Pharmacia公司，RPMI 1640购自Gibco公司，胰岛素放免检测试剂盒购自中国原子能科学院。成年SD大鼠，8-10周龄，体重250-300g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。
1.2 胰岛的分离纯化 成年SD大鼠,腹腔麻醉，剖腹，丝线接扎胆总管入十二指肠处，破心放血处死。胆总管内插管，逆行灌注0.5g/L胶原酶Ⅴ10mL，分离已膨胀胰腺，38℃水浴振荡10min取出，冰浴中撕碎，继续38℃水浴振荡10min后，DHanks液终止消化，未消化组织加入胶原酶Ⅴ继续消化，重复1-2次，直到组织完全消化。收集所有消化液，500μm筛网过滤，DHanks液离心洗涤3遍，沉淀物制成悬液。离心管中，依次加入250、200、110g/L Ficoll分离液和胰岛悬液，3000r/min离心20min，分层，吸出各界面细胞，DHanks液离心洗涤3遍，置入RPMI1640培养液(含150mL/L小牛血清)中，37℃、50mL/L CO2培养箱培养。
1.3 游离脂肪酸对大鼠胰岛细胞分泌功能影响 浓度梯度组：胰岛细胞培养48h后，换用浓度分别为0、0.125、0.25、0.5mmol/L软脂酸和油酸的RPMI 1640培养液，共培养48h后，先后置于浓度为3.3mmol/L(低糖刺激液)、16.7mmol/L(高糖刺激液)葡萄糖培养液中，37℃、50mL/L CO2培养箱孵育2h，收集培养液，放射免疫法测定胰岛素。时间梯度组：胰岛细胞培养48h后，分别以0.25mmol/L PA、OA及二者的混合物(终浓度均为0.25mmol/L)作用于胰岛细胞24、48、72h后，先后置于浓度为3.3mmol/L、16.7mmol/L葡萄糖培养液中，37℃、50mL/L CO2培养箱孵育2h，收集培养液,放射免疫法测定胰岛素。
1.4 统计学处理 数据以±s表示，应用方差分析进行统计学处理，P<0.05为有统计学差异。
2 结 果
2.1 胰岛细胞收获量、纯度及存活率 大鼠胰腺经胶原酶消化后胰岛产量为962-1080个胰岛/胰腺，平均为(1050±59)个胰岛/胰腺；Ficoll400纯化后产量为453-567个胰岛/胰腺，平均为(498±60)个胰岛/胰腺，纯度可达70%，细胞存活率在93%以上。
2.2 不同浓度PA和OA对大鼠胰岛细胞葡萄糖刺激后胰岛素分泌的影响 PA和OA各浓度组低糖和高糖刺激后胰岛素分泌水平均明显减少，与对照组相比有统计学差异(P<0.05)；浓度越高，胰岛素分泌越少，刺激指数(SI=高糖刺激/低糖刺激胰岛素比值)随浓度增高呈递减趋势，各浓度组间相比，胰岛素分泌存在统计学差异(P<0.05)。相同浓度的PA和OA之间相比较，低浓度时(0.125mmol/L、0.25mmol/L)，高糖和低糖刺激后胰岛素分泌量无统计学差异(P>0.05)，高浓度时(0.5mmol/L)，高糖刺激下OA组胰岛素分泌高于PA组，并具有统计学差异(P<0.05)。表1 不同浓度PA和OA对大鼠胰岛细胞葡萄糖刺激后胰岛素分泌的影响(略)
2.3 PA和OA作用胰岛细胞不同时间对葡萄糖刺激后胰岛素分泌的影响 各时间段PA、OA及混合组，高糖和低糖刺激后胰岛素分泌水平均明显减少，与对照组相比有统计学差异(P<0.05)；随作用时间增长，PA和OA组高糖和低糖刺激后胰岛素分泌及SI均呈递减趋势。对照组72h与24h相比，高糖和低糖刺激后胰岛素分泌水平均无统计学差异(P>0.05)，PA组和混合组72h与24h相比，高糖刺激后胰岛素分泌存在统计学差异(P<0.05)，低糖刺激后无统计学差异(P>0.05)，OA组72h与24h相比，高糖和低糖刺激后均无统计学差异(P>0.05)；相同时间段，各组两两比较，高糖和低糖刺激后胰岛素分泌均无统计学差异(P>0.05)。
表2 PA、OA和混合组作用胰岛细胞不同时间对葡萄糖刺激后胰岛素分泌水平的影响(略)
3 讨 论
FFA对胰岛细胞具有双重作用，即生理和病理作用。生理条件下，FFA为胰岛细胞重要的能源物质，并在葡萄糖协助下，刺激胰岛素分泌。然而当胰岛细胞长期暴露于脂肪酸的环境中时，增高的脂肪酸能使β细胞分泌胰岛素的功能降低。在肥胖和糖尿病患者体内存在脂代谢紊乱，胰岛细胞持续暴露于高脂肪酸的环境中，可通过改变葡萄糖、FFAs 代谢过程中的关键酶的活性或表达水平,使胰岛TG含量增加,致使β细胞凋亡、GLUT2 表达下降等多种途径导致机体β细胞分泌功能缺陷。
本实验以原代培养大鼠胰岛细胞为研究对象，发现饱和脂肪酸软脂酸和单不饱和脂肪酸油酸均对大鼠胰岛细胞的分泌功能有一定的抑制作用，不仅损害基础分泌功能，对葡萄糖刺激后胰岛细胞分泌功能也有损害作用，其抑制程度与浓度及作用时间有关，浓度越高毒性越强，呈剂量依赖性，软脂酸抑制作用随时间延长而增强，呈时间依赖性。低浓度时，二者作用无显著差异，高浓度时，PA抑制程度大于OA。说明饱和脂肪酸PA对胰岛细胞的毒性作用比不饱和脂肪酸OA强，而且随着剂量的增加、时间的延长，毒性作用逐渐增强。
有研究认为，饱和脂肪酸促进β细胞凋亡，抑制其增殖和胰岛素分泌；单不饱和脂肪酸中的软油酸不影响其凋亡水平，还可改善饱和脂肪酸损害的胰岛β细胞胰岛素分泌功能。我们选取单不饱和脂肪酸中的油酸为研究对象，发现油酸对饱和脂肪酸PA诱导的胰岛细胞分泌功能损伤并无保护作用，且PA和OA之间也无协同效应。提示降低饱和脂肪酸PA和单不饱和脂肪酸OA的浓度均有助于改善和减轻胰岛β细胞功能受损。
有研究证明，多不饱和脂肪酸中的花生四烯酸(AA)对睾丸Leydig 细胞有刺激生长的作用，并且对饱和脂肪酸导致的卵巢颗粒细胞和Leydig 细胞的凋亡有部分阻断作用。AA还可以部分阻断饱和脂肪酸对血管内皮细胞的损伤作用。说明FFA的毒性作用与其浓度和各种脂肪酸的比例有关，AA对饱和脂肪酸诱导的生殖细胞和血管内皮细胞的损伤具有保护作用。由此推测多不饱和脂肪酸AA也可能会减轻饱和脂肪酸诱导的胰岛细胞的毒性损伤作用。提示可针对AA对胰岛细胞的是否具有保护作用作进一步的研究。
综上所述，高游离脂肪酸水平，尤其饱和脂肪酸水平升高可导致胰岛β细胞分泌功能受损。不饱和脂肪酸OA对胰岛细胞也具有毒性作用，OA对饱和脂肪酸PA诱导的胰岛细胞分泌功能损伤并无保护作用。因此,有效地降低血浆中升高的饱和脂肪酸PA和单不饱和脂肪酸OA的浓度，将有助于改善和减少胰岛β细胞功能受损。
参考文献：
[1]Unger RH, Zhou YT. Lipotoxicity of βcells in obesity and in other causes of fatty acid spillover . Diabetes, 2001,50:S118121.
[2]Unger RH. Lipotoxicity in the pathogenesis of obesitydependent NIDDM . Diabetes,1994,44:863870.
[3]Sako Y, Grill VE. A 48h lipid infusion in the rat dependently inhibits glucoseinduced insulin secretion and Bcell oxidation through a process likely coupled to fatty acid oxidation . Endocrinology, 1990,127:15801589.
[4]Stein DT, Stevenson EB, Lane KE, et al. Essentiality of circulating fatty acids for glucosestimulated insulin secretion in the fasted rat . J Clin Invest, 1996,97:27282735.
[5]Zhou YP, Grill VE. Longterm exposure of rat pancreatic islets to fatty acids inhibits glucoseinduced insulin secretion and biosynthesis through a glucose fatty acid cycle . J Clin Invest, 1994, 93(2):870876.
[6]Stein D, Stevenson BE, Chester MW, et al. The insulinotropic potency of fatty acids is influenced profoundly by their chain length and degree of saturation . J Clin Invest, 1997,100:398403.
[7]Eitel K, Staiger H, Brendel MD, et al. Apoptosis induced by free fatty acids . Med Klin, 2003,98:248252.
[8]Mu YM, Yanase T , Nishi Y, et al. Saturated FFA, palmitic acid and stearic acid , induce apoptosis in human granulosa cells . Endocrinology, 2001,142:35903597.
[9]Lu ZH, Mu YM, Wang BA, et al. Saturated free fatty acids , palmitic acid and stearic acid, induce apoptosis by stimulation of ceramide generation in rat testicular Leydig cell . Biochem Biophys Res Commun, 2003(4),303:10021007.
[10]詹晓蓉，肖或君，母义明,等. 花生四烯酸对饱和脂肪酸的血管内皮细胞毒性的保护作用 . 中华内分泌代谢杂志, 2004, 20:453456.
(1. 西安交通大学医学院第一附属医院内分泌科；
2. 解放军451医院核医学科，陕西西安 710061)
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