组织工程活性真皮的构建研究
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胡葵葵 ,戴育成 ,袁敬东
胶原;成纤维细胞;支架材料;脱细胞基质
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作者简介：胡葵葵(1968)，女(汉族)，医学博士，副主任医师，副教授，硕士生导师.研究方向：皮肤组织工程.
摘要：目的 探讨用脱细胞真皮(ADM)、胶原海绵膜(SCM)、胶原凝胶构建活性真皮的可行性。方法 从幼儿包皮中纯化、扩增成纤维细胞(Fb)，将其分别种植于ADM、胶原凝胶、SCM上，观察细胞增殖及支架收缩等情况。结果 Fb在ADM上不能成活；在SCM上增殖良好，人工真皮收缩不明显；在胶原凝胶中增殖活跃，但人工真皮收缩明显。结论 利用SCM构建的人工真皮，是一种较理想的活性真皮。
关键词： 胶原；成纤维细胞；支架材料；脱细胞基质
An experimental study on the preparation of artificia dermisHu Kuikui, Dai Yucheng, Yuan Jingdong
(1. Center of Plastic, Laser and Cosmetic Surgery, the Second Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College, Nanchang 330006;
2. Key Laboratory of Molecular Medicine of Jiangxi Province, Nanchang 330006, China)
ABSTRACT: Objective To build artificial dermis by using the acellular dermis, collagen membrane and collagen gel as scaffolds. Methods The fibroblasts were isolated from infant skin. The 3rd generation cells were seeded into 3 different scaffolds. The artificial dermis was detected by HE staining, phase contrast microscope or scanning electron microscope. Results The fibroblasts implanted on the ADM began to rupture and died after 2 to 3 days. Though the fibroblasts proliferated well in collagen gel, the artificial dermis contracted obviously. Another artificial dermis contracted slightly by inoculating fibroblasts on collagen membrane, and the fibroblasts on them were in appropriate proliferation. Conclusion The artificial dermis built by collagen membrane as scaffolds has a preferable structure for an ideal substitute of skin.
KEY WORDS:collagen; fibroblast; trestle; acellular dermis matrix
皮肤组织工程的核心内容即创造出一种三维生长支架，将由肌体分离出的表皮细胞或成纤维细胞进行体外复合培养，形成人工再生的真皮等同物或皮肤等同物，移植于需要修复、重建的皮肤缺损处。在皮肤组织工程中，寻找能充分发挥组织再生潜能的细胞外基质材料是核心内容。真皮为皮肤提供牢固的机械保护并决定它的外观特征。 活性真皮的研制是皮肤组织工程研究中的重点及难点所在。本实验制备胶原海绵膜
(sponge collagen membrane, SCM)、脱细胞真皮(acellular dermis matrix, ADM) 、胶原凝胶三种支架，并将成纤维细胞种植于支架上，观察其成活情况，以期为组织工程皮肤的制备奠定基础。
1 材料与方法
1.1 胶原制备 取体重250g左右的SD大鼠1只(江西医学院实验动物部)，消毒后将鼠尾切成1.5cm小段，剔除皮毛，抽出尾腱置平皿中。取1.5g剪碎尾腱浸入0.05mol/L 乙酸(西安化学试剂厂)，置4℃冰箱中，并不时摇动，48h后，移入灭菌离心管中。4000r/min离心30min，吸取上清液，按100mL上清液加5g NaCl的比例加入NaCl晶体，可见多量沉淀析出，再次1000r/min离心10min，弃去上清液，所得沉淀即为胶原。经冷冻干燥后称重，保存于4℃冰箱中备用。
1.2 SCM的制备 将提取的胶原重新溶解于0.05mol/L乙酸中，制成2.5g/L的胶原溶液。将6硫酸软骨素C(Ch6S，美国Sigma公司)溶液滴加于胶原溶液中，搅拌混匀，Ch6S的终质量浓度为80g/L。将上述溶液倒入平底培养皿中，厚约2-3mm；放入-30℃的冰箱内预冻4h以上。将预冻后的胶原快速转入真空干燥机内，真空冷冻干燥36h。待样品温度回升到室温，再逐步加热至105℃，恒温24h即成为SCM。将上述制备的胶原膜浸入0.2%(体积分数)戊二醛(上海化学试剂站)溶液中10min，用过滤自来水漂洗2h，然后换成双蒸水置4℃冰箱24h，去除未结合残存的戊二醛。交联后的胶原海绵，贮存于75%(体积分数)乙醇内备用。
1.3 SCM的检测 采用扫描电镜对支架表面进行扫描，测量其表面孔径大小。将SCM置于10%(体积分数)中性甲醛中固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及脱蜡后，HE染色。并按下面方法进行孔隙率的检测。孔隙率=\[浸润DHanks的重量(g)-冷冻干燥后的重量(g)\]/体积(cm3)×100%。共检测10块，取平均值。
1.4 ADM的制备 取刚处死的健康、成年猪背部皮肤，剃毛洗净，用取皮刀取中厚皮片(3-5mm)，无菌操作下修成2cm×2cm大小皮片，置于饱和浓度的NaCl中。过夜，撕去表皮，PBS液冲洗后置于含0.5mmol乙二酸二乙胺(EDTA)+2.5g/L胰蛋白酶溶液中，4℃，48h ，脱去真皮内的所有细胞成分。此过程中加用叠氮化钠(0.2mg/L),防止细菌污染。然后将制得的皮片室温下置于体积分数为0.05% Triton X100溶液中，持续震摇24h即制得ADM。将上述制备的ADM浸入0.2%(体积分数)戊二醛溶液中10min，无菌PBS液充分冲洗后，保存于4℃ PBS液中备用。
1.5 ADM的检测 ①将制备的猪脱细胞真皮基质行HE染色，光镜下观察；②将制备的猪脱细胞真皮基质处理后于扫描电镜下观察。
1.6 利用脱细胞基质构建活性真皮 交联型及未交联型ADM的表皮面较平滑，真皮面较粗糙。将粗糙面向上，置入6孔板中，用IMDM培养基浸泡48h，将传代培养的第3代成纤维细胞(fibroblasts, Fb)以1.0×106/cm2密度种植于ADM上，IMDM加10%(体积分数)小牛血清， 37℃、5%(体积分数)CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。隔天换液。倒置显微镜下观察细胞生长和形态变化情况。培养后第7天，分别行10%(体积分数)中性甲醛固定和2%(体积分数)戊二醛固定，进行HE染色和扫描电镜观察。
1.7 利用胶原凝胶构建活性真皮 在冰浴条件下先后加入一定量的2倍IMDM培养基、新生小牛血清、Ⅰ型胶原、Ch6S，每一步都充分搅拌混匀。用1mol/L NaOH调pH至7.2-7.4，迅速加入Fb悬液并混匀。将该凝胶吸入6孔培养板，每孔加1mL，使孔中的Fb终密度为5×105/cm2。10min左右凝胶凝固。每孔加IMDM(2mL)、10%(体积分数)小牛血清，37℃、5%(体积分数)CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。隔天换液。倒置显微镜下观察细胞的生长和形态变化情况。
1.8 利用人工SCM构建活性真皮 交联型SCM置入6孔板中，用IMDM浸泡48h，将传代培养的第3代Fb以1.0×106/cm2密度种植于ADM上， IMDM加10%(体积分数)小牛血清，37℃、5%(体积分数)CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。隔天换液。倒置显微镜下观察细胞生长和形态变化情况。
2 结 果
2.1 SCM的检测 制备的胶原呈白色粉末状，冷冻干燥形成的胶原膜，表面较平整，孔洞均匀，柔软，弹性好，吸水性强，挤出水后再放入水中可立即恢复原状。胶原纤维相互连接成多孔网状结构，网孔大小基本一致，约50-100μm(图1a)。HE染色，可见支架呈浅红色，波浪状，常有分支并互相交织。孔隙率(85±3.7)%。
2.2 ADM的检测 交联型ADM呈微黄色，韧性及弹性较好。经HE染色行组织学检查，交联前后ADM与正常小猪真皮和人真皮细胞外基质的组织形态学结构十分相近。镜下见成束的胶原纤维，未见有细胞。扫描电镜观察交联的ADM见表皮显示面排列规则的纤维束，由于乳头突起和皮钉凹陷，显现规律的凹凸不平，未见表皮基底细胞附着。ADM的真皮面部分胶原纤维断裂，但排列整齐，间有大小均匀的孔隙(图1略)。
2.3 利用脱细胞基质构建的活性真皮 接种后2h，倒置显微镜下，从交联型和非交联型真皮块周边观察到细胞种植后5-6h开始贴壁，皮块周边亦有较多细胞生长。2d内细胞透明，状态良好，真皮块较薄部位可见一些圆形不透光影，考虑为植入的Fb。第3天起，真皮块周边的Fb逐渐漂浮死亡，第4天见整个培养皿的真皮块周边的Fb均死亡。真皮块因不透光，其中的Fb状态不能确定。1周时HE染色及扫描电镜均未见细胞(图2a略)。
2.4 利用胶原凝胶构建的活性真皮 培养后2h，倒置显微镜下可见Fb呈椭圆形，有小的突起伸出，6h细胞完全展开，2d后Fb逐渐增多，在胶原凝胶中由不均匀分布变成均匀，细胞呈星形，排列无一定方向。随着凝胶的收缩，它逐渐与培养板壁和底分离，漂浮于培养液中，面积缩小，厚度变薄，透光度下降。第10d，胶原基质收缩约50%左右，第21d，收缩至原来的60%，以后，收缩逐渐减慢。真皮Fb较在ADM和SCM两种人工真皮上生长旺盛(图2b略)。
2.5 利用人工SCM构建的活性真皮 倒置显微镜下见SCM周边及SCM网孔中有Fb贴壁，3d后细胞开始增殖，在SCM 表面及网孔内生长。培养至14d，镜下可见网孔内被Fb及其所分泌的基质填充(图2c略)。Fb在SCM中增殖较ADM上活跃，但比在胶原凝胶中慢。SCM未见明显收缩。
3 讨 论
目前，含活性Fb的真皮支架有Dermagraft、SCM等。Hansbrough等 在 PGA/PLA网上种植异体成纤维细胞，培养2-3周，网孔中可被融合的Fb及其合成分泌的基质填充，植入创面后易于血管化，适于与网状皮片复合移植。但当不种植Fb时，单纯的PGA/PLA网血管化较慢，导致重叠移植的网状皮片坏死。因此，在人工替代物中引入成纤维细胞，可提高生物亲和性，加速新生血管形成。这可能与其分泌多种细胞因子、生长因子和细胞外基质成分，从而增强真皮替代物的亲和性，促进血管化有关。
ADM基本能保持细胞外基质(ECM)的主要成分及结构。由于其脱去了细胞成分，从而最大限度地降低了免疫原性，且有较高的组织相容性，为其应用于创面修复提供了物质基础。国内肖仕初等\[10\]报道在ADM上种植Fb构建活性人工真皮，细胞基本上是在表面生长，向支架内部生长缓慢。本实验Fb在交联型及未交联型ADM上培养2-3d开始破裂、死亡，可能与ADM上残留有一定毒性的化学物质对细胞的毒性较大有关。虽然ADM均经PBS液反复浸泡，但仍对细胞有毒性，初步推测与TritonX100有关。
胶原凝胶的组织学特性接近正常真皮，在制备时不需添加人造材料，使用的Fb数量少，不加可能有毒的合成聚合物和交联剂，制备过程简单。本研究结果发现，胶原凝胶真皮Fb较在SCM上生长旺盛，但存在收缩度大、易感染、脆性较高、难操作、移植后在创伤部位抗胶原酶能力差及降解较快等缺点。
理想的人工真皮，其内部应具有一定大小的孔径，以利于组织中Fb和毛细血管的长入，并且在移植后一段时间保持其网状结构。这样即具有合适的被吸收率和降解速度，同时，还应当具有良好的创面黏附性。胶原作为天然的生物材料，本身无毒性，其降解产物可被机体吸收，不对机体产生危害；同时，胶原的三维空间结构具有一定的强度，是构建组织工程支架的良好原料。胶原蛋白基质网架对皮肤Fb增殖具有调节作用。本实验将Fb种植于胶原海绵上，Fb在表面形成一单层，网孔间隙内被Fb及其分泌的基质充满，SCM不收缩，培养至21d无降解。表明它为新生真皮的Fb提供了附着的场所，为细胞贴壁增殖和分化提供了立体空间，显示了良好的应用前景。
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(江西医学院第二附属医院：1.整形激光美容中心；
2. 江西省分子医学重点实验室，江西南昌 330006)
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