大鼠比目鱼肌肌梭内神经末梢的快速银染方法
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朱永进,樊小力,吴苏娣,宋新爱
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摘要：目的 建立快速稳定的肌梭内神经末梢的银染方法。方法 分离出单一肌梭，对吕荣等人的运动终板及神经末梢的快速银染方法做了适当的改良，用于肌梭内神经末梢的染色。结果 肌梭赤道部与两极部神经末梢呈棕黑色，清晰可见，梭内肌纤维染为棕黄色。结论 改良的肌梭内神经末梢的快速银染方法，操作简单，神经末梢显示清晰。
关键词：肌梭；快速银染；神经末梢
Fast silverstaining of nerve endings of muscle spindle in rat soleus muscle
Zhu Yongjin, Fan Xiaoli, Wu Sudi, Song Xinai
(Department of Physiology, Medical School of Xian Jiaotong University, Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases of Ministry of Education, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To establish stable silverstaining method for showing nerve endings of muscle spindle in rats soleus muscle. Methods According to argentaffine of nerve fibers, fast silverstaining was used to observe morphology of nerve endings of isolated muscle spindle in rats soleus muscle. Results Nerve endings of muscle spindle in equatorial and polar regions were dyed black; intrafusal fibers were dyed buffy. Conclusion Fast silverstaining can easily used to show the nerve endings of muscle spindle in rats soleus muscle.
KEY WORDS: muscle spindle; fast silverstaining; nerve endings
肌梭对肌紧张的产生和维持以及对随意运动的精细调节起着至关重要的作用，肌梭内神经末梢的病理改变对其生理功能有很大的影响。目前神经末梢的银染方法较多，但其染色时间均较长，且方法不稳定。在本研究中，我们对吕荣等人\[1\]的运动终板及神经末梢的染色法进行了适当的修改，取得了较好的效果，从而为肌梭形态结构的研究提供了实验资料。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康活泼的SpragueDawley雌性大鼠，体质量180-220g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
1.2 比目鱼肌单一肌梭标本的制备 大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg)，麻醉后，打开胸腔，暴露心脏，经左心室插管至主动脉，依次灌流生理盐水100mL、40g/L多聚甲醛500mL，灌流1.5h以上，至组织呈一定硬度且无血色后，取后肢比目鱼肌，并将其置于含有100g/L氯化钙的10%(体积分数)的甲醛溶液，冰箱保存过夜。将固定好的比目鱼肌标本置于玻璃板上，在双目解剖显微镜下沿肌纤维走行，用分离针仔细将比目鱼肌分离为若干条扁薄的肌片，分别采用聚光灯光源和冷光源为双目解剖显微镜和倒置显微镜照亮视野。调节双目解剖显微镜的位置，使其焦点与倒置显微镜焦点重合，在双目解剖显微镜和倒置显微镜下辨认肌梭。肌梭与梭外肌呈并联关系，以其呈梭形膨大的赤道部和较强的折光性为辨认标志。调整光源的位置，使解剖镜视野明亮度适宜，便于观察分离肌梭。用分离针去除肌梭周围相连的梭外肌纤维、血管等组织，将肌梭完整地分离出来。固定后的肌梭脆性较大，极易损伤，分离时切勿用力牵扯。肌梭在分离过程中尽量保持其形态的完整和表面的光滑，便于染色。在解剖显微镜下，将分离出的肌梭直接贴于经铬钒明胶处理过的载玻片上，并使肌梭平铺展开。
1.3 改良的快速银染方法 肌梭标本的载玻片自然风干后，可依次进行以下步骤：80%(体积分数)的乙醇硬化5-6min后，蒸馏水冲洗2遍；50%(体积分数)的吡啶酒精，恒温箱(37℃)2-4h，蒸馏水洗去酒精吡啶液；200g/L硝酸银37℃孵育1-2h，注意避光；10%(体积分数)的中性甲醛溶液浸洗3-4次，直至见不到乳白色液为止；然后用1%(体积分数)的中性甲醛溶液洗1、2次；最后蒸馏水冲洗2遍，用滤纸吸干水滴；滴加银铵溶液2-3滴于载玻片的肌梭标本处，迅速显微镜下观察，可有淡淡的棕色，1min内将载玻片置入1%(体积分数)的中性甲醛溶液，并立即移出，镜下观察，至肌梭内黑褐色神经末梢清晰出现，此时，整个肌梭呈棕黄色；蒸馏水冲洗，入50g/L的硫代硫酸钠固定1min，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，树胶封片。
2 结果
2.1 单一肌梭整体染色效果 肌梭整体呈棕黄色(图1a)，赤道部可见包囊边界清晰，梭内肌淡染为黄色，神经末梢为棕黑色，缠绕于梭内肌纤维上。
2.2 肌梭赤道部神经纤维 肌梭赤道部Ia类传入纤维(图1b)呈螺旋状缠绕于梭内肌纤维上，靠近极部的II类纤维呈树枝状分布(图1c)。
2.3 肌梭极部神经纤维 肌梭两极部属运动终末，主要是γ、β运动神经末梢(图1d)与梭内肌构成终板结构(图中箭头所示)。
图1 大鼠比目鱼肌肌梭内神经末梢的快速银染结果(略)
Fig.1 Nerve endings of muscle spindle in solens muscle of rats (showing by fast silverstaining)
a: Single soleus muscle spindle of rat ×100; b: Primary sensory nerve endings in equatorial region of soleus muscle spindle ×400; c: Secondary sensory nerve endings in equatorial region of soleus muscle spindle ×1000; d: Motor endings in polar region of soleus muscle spindle×400
3 讨论
肌梭是骨骼肌内重要的本体感受器，主要感受肌肉张力、长度、收缩速度等的变化，通过反射通路，对肌紧张和机体的随意运动进行调节。在某些特定环境下(如失重和肌肉废用)，肌梭的病理改变和骨骼肌的功能相互影响，进而对机体产生不良的影响。例如，失重/模拟失重环境下，骨骼肌肌肉萎缩的发生、发展就与肌梭结构和功能的改变密切相关\[24\]。因此，进一步了解肌梭的神经支配对深入研究肌梭有重要的作用。
目前，神经末梢的银染方法较多，主要有Fawosky染色、Golgi染色、Beilschowsky法、氯化金法及SevierMunger 改良法等，但对肌梭内神经末梢的染色均有不尽人意之处。Fawosky法采用组织块浸染、切片观察的方法，显示肌梭神经末梢\[5\]效果虽可，但染色周期漫长(组织块酸酒精固定10d，后续入氨水酒精2d，入纯吡啶2d，入硝酸银溶液10d，最后将标本沿肌肉长轴作纵向切片)，且切片后不能相对完整的显示肌梭的结构特点。Beilschowsky法对单一肌梭的效果较差，不能清晰显示肌梭神经末梢，且周期亦较长(约需一周)。快速Golgi染色主要用于神经元胞体和突起的形态研究。氯化金法常采用组织块浸染后压片观察的方法，不适用单一肌梭的染色。与上述方法相比，我们改良的银染方法有如下优点：①分离出单一肌梭，解决了以往的切片、压片等不能完整显示肌梭结构的缺点；②缩短了染色时间，整个染色过程仅需5-6h；③本法操作简单，容易掌握，能较为清晰地显示单一肌梭内的Ia类、II类传入纤维和运动末梢。
参考文献：
\[1\]吕荣，南耘，杨光. 运动终板及神经末梢的快速染色法 \[J\]. 中国修复重建外科杂志，1996，10(4):258.
\[2\] 吴苏娣， 樊小力， 唐斌,等. 模拟失重对大鼠比目鱼肌肌梭超微结构的影响 \[J\]. 航天医学与医学工程, 2002,15(1):3235.
\[3\]Tang B, Fan XL, Wu SD. Effects of tail suspension on electrophysiological characteristics of muscle spindles in isolated rat soleus muscle \[J\]. Space Med Med Eng (Beijing), 2004,17(1):16.
\[4\]Zhang HM, Fan XL, Zhou JB, et al. Effects of simulated microgravity on immunoreactivity of conjugatedubiquitin of muscle spindles of soleus in rats \[J\]. J Gravit Physiol, 2000, 7(2):119120.
\[5\]唐斌，樊小力，吴苏娣,等. 模拟失重对大鼠比目鱼肌肌梭神经末梢形态的影响 \[J\]. 航天医学与医学工程, 2003,16(3):162164.
(编辑 卓选鹏)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30300106)
作者简介：朱永进(1977)，男(汉族)，在读博士，主要从事肌梭与肌萎缩的研究.
(西安交通大学医学院生理学教研室，西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061)
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