花背蟾蜍血清蛋白成分的电泳分析
【关键词】 花背蟾蜍；血清蛋白质；电泳
0引言
花背蟾蜍(Bufo raddei)为两栖纲动物，具有强心利尿,解毒清热的作用，对一些恶性肿瘤也有明显抑制效果，抗癌总有效率达93%[1]. 有关蟾蜍血清蛋白质成分的研究见于何士敏等[1]和刘建强等[2]. 我们对陕西花背蟾蜍血清蛋白质的成分进行了分析，为进一步开发这种药用动物资源提供了理论依据.
1材料和方法
1.1材料采于西安渭河滩蟾蜍，将其洗净，用探针捣毁其脑组织及脊髓，打开胸腔，采心脏新鲜血(每只可抽出1 mL左右)，立即注入小型离心管内静置2 h后进行离心(4000 r/min，15 min)，吸取上面黄色血清备用.
1.2方法参照醋酸纤维薄膜电泳法[3]. 用氨基黑10B染色液染色10 min,然后用漂洗液漂洗3次，每次5 min，即可在薄膜上出现清晰的谱带. 选取谱带多而清晰的薄膜量取膜上各条带的泳动距离，然后放在清水中进行照相. 拍照后，对入选膜进行定量测定，即将薄膜上的各个蛋白带剪下，分别放入9支试管中，同时在相应膜上剪下大小相同的无蛋白区的薄膜放入第10支试管中作为空白对照. 然后向各管加入NaOH溶液(0.4 mol/L) 4 mL，在37℃条件下水浴30 min后浸泡12 h，在722型分光光度计620 nm处比色，记录A620 nm值. 根据各蛋白区带的A620值计算其相对含量. 各种蛋白质的相对含量等于其A620 nm值占蟾蜍血清蛋白A620 nm总值的百分比. 泳动度按U=dL/Vt公式计算[4]，式中d为电泳图谱中各条带的泳动距离，L为支持物的有效长度,V为110 V，t为7200 s.
2结果
2.1血清蛋白质电泳分析花背蟾蜍经醋酸纤维薄膜电泳分离出9条谱带，即该血清含有9种蛋白质，在清蛋白区有4种，在球蛋白区有5种，从正极端开始，依次为：α2清蛋白,α1清蛋白,β2清蛋白，β1清蛋白,α球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白,δ球蛋白,ε球蛋白. 9种蛋白质的分类及编号参照常规的人血清蛋白质电泳图中各种蛋白质的名称编号得来，各蛋白带的泳动度(表1).
2.2花背蟾蜍血清蛋白质相对含量从蟾蜍血清中分离出9条蛋白质谱带的吸光度总和A总=0.342. 其中，5种球蛋白的吸光度总和A球=0.133，4种清蛋白的光密度总和A清=0.209，球蛋白和清蛋白的比例为1∶1.56，蟾蜍血清中各种蛋白质占血清总蛋白质的百分含量(表1).
表1蟾蜍血清中各蛋白的泳动度(略)
3讨论
我们研究表明，陕西花背蟾蜍的血清蛋白质经醋酸纤维薄膜电泳分离出的9种蛋白质的泳动度和相对含量与青海和东北蟾蜍血清蛋白质的电泳分析存在异同，相同之处在于：1,2,3,4条带(清蛋白)和5,6,7,8,9,条带(球蛋白)呈集团性分布，两区之间有明显的蛋白空白区. 前4种蛋白质的等电点都较小，偏离缓冲液的pH 8.6较远，故带负电荷较多，泳动度较快，属于清蛋白. 后5种蛋白质的等电点都较大，偏离缓冲液的pH 8.6较近，故带负电荷较少，泳动度较慢，属于球蛋白. 清蛋白质的泳动度大于球蛋白质不同的是，经染色后观察，清蛋白区中有3条带比较浓，相对含量都比较高，所有的蛋白带中，δ与ε的含量之比接近1∶1，α与β的含量之比也接近1：1. 球蛋白区的中间一条带较浓，含量较高(17.3%)，球蛋白区的δ球蛋白较淡，含量最低(4.5%). 清蛋白区的α1清蛋白较淡，含量较低(6.6%)，而α2清蛋白较浓，含量最高(24.6%). 生活在西安花背蟾蜍的血清蛋白质的种类与青海和东北蟾蜍血清蛋白质的种类相同，但其相对含量和泳动度与其他二者均不相同，这为三地蟾蜍在药用资源上是否可以替代提供了一个可参考的依据.
另外，我们制作了一支点样笔，经试验，效果理想. 点样时应将薄膜表面多余的缓冲液吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散，但不能吸的太干，太干样品不易进入薄膜的网孔，造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果. 而且点样量不能过大，否则易拖尾，分离效果不好. 取样完成后，应该立即进行电泳，实验效果好，使用冷藏后的样品电泳分离后，得到的条带模糊不清实验效果明显降低. 洗脱时要放在37℃水浴中浸提30 min,每隔10 min充分摇动1次，以便将色泽完全洗脱下来，然后在常温下浸泡12 h，测定各管A620 nm值[4].
【参考文献】
[1] 何士敏, 王鑫. 东北蟾蜍血清蛋白质成分初步分析[J]. 生物科技, 2000,10(2):43-45.
[2] 刘建强, 孟青妹. 青海蟾蜍血清蛋白质成分的电泳分析[J].中国兽医科技, 2003,3(10):64-65.
[3] 林加涵, 魏文玲, 彭宣宪. 现代生物学实验下册[M].北京: 高等教育出版社, 2001：41-44.
[4] 王秀奇, 秦淑媛, 高天慧, 等. 基础生物化学实验[M].北京: 高等教育出版社, 2004:52-53,143.
编辑许昌泰
基金项目：陕西省自然科学基金(2003C127)
(延安大学生命科学学院，陕西 延安 716000), 百拇医药(李延清,刘长海，徐世才，乔文兰，翟小强,于彬)
0引言
花背蟾蜍(Bufo raddei)为两栖纲动物，具有强心利尿,解毒清热的作用，对一些恶性肿瘤也有明显抑制效果，抗癌总有效率达93%[1]. 有关蟾蜍血清蛋白质成分的研究见于何士敏等[1]和刘建强等[2]. 我们对陕西花背蟾蜍血清蛋白质的成分进行了分析，为进一步开发这种药用动物资源提供了理论依据.
1材料和方法
1.1材料采于西安渭河滩蟾蜍，将其洗净，用探针捣毁其脑组织及脊髓，打开胸腔，采心脏新鲜血(每只可抽出1 mL左右)，立即注入小型离心管内静置2 h后进行离心(4000 r/min，15 min)，吸取上面黄色血清备用.
1.2方法参照醋酸纤维薄膜电泳法[3]. 用氨基黑10B染色液染色10 min,然后用漂洗液漂洗3次，每次5 min，即可在薄膜上出现清晰的谱带. 选取谱带多而清晰的薄膜量取膜上各条带的泳动距离，然后放在清水中进行照相. 拍照后，对入选膜进行定量测定，即将薄膜上的各个蛋白带剪下，分别放入9支试管中，同时在相应膜上剪下大小相同的无蛋白区的薄膜放入第10支试管中作为空白对照. 然后向各管加入NaOH溶液(0.4 mol/L) 4 mL，在37℃条件下水浴30 min后浸泡12 h，在722型分光光度计620 nm处比色，记录A620 nm值. 根据各蛋白区带的A620值计算其相对含量. 各种蛋白质的相对含量等于其A620 nm值占蟾蜍血清蛋白A620 nm总值的百分比. 泳动度按U=dL/Vt公式计算[4]，式中d为电泳图谱中各条带的泳动距离，L为支持物的有效长度,V为110 V，t为7200 s.
2结果
2.1血清蛋白质电泳分析花背蟾蜍经醋酸纤维薄膜电泳分离出9条谱带，即该血清含有9种蛋白质，在清蛋白区有4种，在球蛋白区有5种，从正极端开始，依次为：α2清蛋白,α1清蛋白,β2清蛋白，β1清蛋白,α球蛋白,β球蛋白,γ球蛋白,δ球蛋白,ε球蛋白. 9种蛋白质的分类及编号参照常规的人血清蛋白质电泳图中各种蛋白质的名称编号得来，各蛋白带的泳动度(表1).
2.2花背蟾蜍血清蛋白质相对含量从蟾蜍血清中分离出9条蛋白质谱带的吸光度总和A总=0.342. 其中，5种球蛋白的吸光度总和A球=0.133，4种清蛋白的光密度总和A清=0.209，球蛋白和清蛋白的比例为1∶1.56，蟾蜍血清中各种蛋白质占血清总蛋白质的百分含量(表1).
表1蟾蜍血清中各蛋白的泳动度(略)
3讨论
我们研究表明，陕西花背蟾蜍的血清蛋白质经醋酸纤维薄膜电泳分离出的9种蛋白质的泳动度和相对含量与青海和东北蟾蜍血清蛋白质的电泳分析存在异同，相同之处在于：1,2,3,4条带(清蛋白)和5,6,7,8,9,条带(球蛋白)呈集团性分布，两区之间有明显的蛋白空白区. 前4种蛋白质的等电点都较小，偏离缓冲液的pH 8.6较远，故带负电荷较多，泳动度较快，属于清蛋白. 后5种蛋白质的等电点都较大，偏离缓冲液的pH 8.6较近，故带负电荷较少，泳动度较慢，属于球蛋白. 清蛋白质的泳动度大于球蛋白质不同的是，经染色后观察，清蛋白区中有3条带比较浓，相对含量都比较高，所有的蛋白带中，δ与ε的含量之比接近1∶1，α与β的含量之比也接近1：1. 球蛋白区的中间一条带较浓，含量较高(17.3%)，球蛋白区的δ球蛋白较淡，含量最低(4.5%). 清蛋白区的α1清蛋白较淡，含量较低(6.6%)，而α2清蛋白较浓，含量最高(24.6%). 生活在西安花背蟾蜍的血清蛋白质的种类与青海和东北蟾蜍血清蛋白质的种类相同，但其相对含量和泳动度与其他二者均不相同，这为三地蟾蜍在药用资源上是否可以替代提供了一个可参考的依据.
另外，我们制作了一支点样笔，经试验，效果理想. 点样时应将薄膜表面多余的缓冲液吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散，但不能吸的太干，太干样品不易进入薄膜的网孔，造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果. 而且点样量不能过大，否则易拖尾，分离效果不好. 取样完成后，应该立即进行电泳，实验效果好，使用冷藏后的样品电泳分离后，得到的条带模糊不清实验效果明显降低. 洗脱时要放在37℃水浴中浸提30 min,每隔10 min充分摇动1次，以便将色泽完全洗脱下来，然后在常温下浸泡12 h，测定各管A620 nm值[4].
【参考文献】
[1] 何士敏, 王鑫. 东北蟾蜍血清蛋白质成分初步分析[J]. 生物科技, 2000,10(2):43-45.
[2] 刘建强, 孟青妹. 青海蟾蜍血清蛋白质成分的电泳分析[J].中国兽医科技, 2003,3(10):64-65.
[3] 林加涵, 魏文玲, 彭宣宪. 现代生物学实验下册[M].北京: 高等教育出版社, 2001：41-44.
[4] 王秀奇, 秦淑媛, 高天慧, 等. 基础生物化学实验[M].北京: 高等教育出版社, 2004:52-53,143.
编辑许昌泰
基金项目：陕西省自然科学基金(2003C127)
(延安大学生命科学学院，陕西 延安 716000), 百拇医药(李延清,刘长海，徐世才，乔文兰，翟小强,于彬)