流动注射化学发光法测定大豆异黄酮
摘要 基于在NaOH碱性介质中，K3Fe(CN)6可以直接氧化大豆异黄酮产生强的化学发光这一现象，并结合流动注射分析技术，提出了直接化学发光测定大豆异黄酮含量的新方法。当K3Fe(CN)6浓度为5.0×10-4 mol/L，NaOH浓度为0.5 mol/L，主副蠕动泵转数分别为45 r/min和35 r/min时，体系具有最强的化学发光。该方法测定大豆异黄酮的线性范围为1.0×10-3～0.5 g/L;其回归方程为A (峰面积)= 193305C(mg/L) + 229.97，r=0.9962;检出限为4.6×10-4 g/L。对5.0×10-3 g/L大豆异黄酮溶液连续测定，每次得3个峰值，重复7次，相对标准偏差为2.46%。本方法已用于大豆中异黄酮含量的测定。
关键词 流动注射，化学发光，大豆异黄酮
1 引言
大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的次生代谢产物，属于黄酮类化合物，主要以异黄酮糖苷和相应的苷元形式存在[1,2]。大豆异黄酮具有弱雌激素、抗氧化、抗溶血和抗真菌等活性，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多种疾病的发生[3，4]。超声波具有强烈振动和空化效应，可以加速有效成分的溶出，从而缩短提取时间，提高产物得率[5]。在大豆异黄酮的乙醇提取液中，色素、糖和醇溶性蛋白等杂质也一起被提取出来。异黄酮与杂蛋白的紫外吸收峰较近，若用紫外分光光度法测定大豆异黄酮的含量，背景吸收较大，杂质将严重干扰异黄酮的测定。研究发现，在碱性介质中，K3Fe(CN)6可以直接氧化大豆异黄酮产生较强的化学发光，从而克服了杂质的影响。因此，提出了一种测定大豆异黄酮含量的流动注射化学发光法。该方法具有操作简便，灵敏度高，线性范围宽，成本低，且具有测定大批量的异黄酮等优点，已成功地用于大豆中异黄酮的测定。
2 实验部分
2.1 材料、试剂和仪器
测定用大豆样品(化学诱变东农42大豆品种，在其后代中筛选出来遗传稳定的第5代品系HK808[6])；大豆异黄酮标准品(为日本和光纯药工业株式会社)。其余试剂均为国产分析纯。
KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LS45荧光光度计(美国Perkin Eimer公司)；MPIB型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈电子有限公司)。
2.2 实验方法
化学发光分析仪的主蠕动泵分别将载流H2O和K3Fe(CN)6溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入分析系统。待基线平稳后，副蠕动泵将大豆异黄酮溶液以35 r/min的流速通过十六通注射阀(注样时间：10 s)注入载流中，与K3Fe(CN)6溶液混合，在流通池中产生化学发光，根据化学发光强弱采用外标法定量。
3 结果与讨论
3.1 化学发光动力学曲线
K3Fe(CN)6氧化大豆异黄酮产生化学发光(图1)，从进样到化学发光达到最大值约为4 s。6 s后发光强度衰减至本底附近。
3.2 测定大豆异黄酮条件的选择
3.2.1 氧化剂的选择 在酸性介质(1 mol/L H2SO4)中KMnO4和在碱性介质(0.5mol/L NaOH)中K3Fe(CN)6、H2O2分别做氧化剂,进行直接氧化异黄酮产生化学发光的研究表明，酸性KMnO4的氧化性强于碱性K3Fe(CN)6，酸性KMnO4不仅可以氧化异黄酮，还可以氧化多羟基醇、糖、维生素C等物质，影响实验效果;而K3Fe(CN)6在该体系中只氧化异黄酮。因此，本实验选择碱性的K3Fe(CN)6作为氧化剂。
图1 化学发光动力学曲线(略)
Fig.1 Kinetic curve of chemiluminescence
异黄酮: 0.5 g/L; NaOH: 0.5 mol/L; K3Fe(CN)6: 5.0×10-4 mol/L。
3.2.2 K3Fe(CN)6与NaOH浓度影响 K3Fe(CN)6的浓度对该体系化学发光强度有很大影响。本实验在固定了大豆异黄酮和碱性介质的浓度下，考察了不同浓度K3Fe(CN)6(0～1×10-3mol/L)和NaOH(1.0×10-5～1.0 mol/L)对该化学发光反应的影响。结果表明，当K3Fe(CN)6的浓度为5.0×10-4 mol/L时，发光强度最大(图2)。K3Fe(CN)6只有在碱性介质中，才能氧化大豆异黄酮产生化学发光。而NaOH的最佳浓度为0.5 mol/L。
3.2.3 流速的影响 在该化学发光流动体系中，流速太慢导致最大发光在流通池之前；流速太快导致发光在流通池之后。主蠕动泵和副蠕动泵转数为0～99 r/min，对它们的转数进行了组合设定发现，最佳转数分别为45和35 r/min。
图2 K3Fe(CN)6的影响(略)
Fig.2 Effect of K3Fe(CN)6 concentration on the chemiluminesecence intensity
从进样到化学发光达到最大值需要2 s，调整阀池距为2 cm时使最大发光恰好能被光电倍增管完全检测。
3.2.4 线性范围、检出限及灵敏度 在最佳条件下，测定了峰面积(A)与大豆异黄酮浓度(C)的关系，结果表明，大豆异黄酮浓度在1.0×10-3～0.5 g/L的范围内具有良好的线性关系，其回归方程为：A=193305C(mg/L)+229.97，r=0.9962。对5.0 mg/L大豆异黄酮溶液连续测定，每次得3个峰值，重复7次，相对标准差为246%。根据IUPAC的建议，本方法的检出限为4.6×10-4 g/L。
3.3 干扰实验
在提取大豆过程中共存其它组分(蛋白质、无机盐、糖类、皂甙等)，它们可能对该化学发光体系测定大豆异黄酮有一定的影响。研究结果表明：1000倍的Na+、Cl-、K+、Br-、CO2-3、SO2-4和NO-3，100倍的淀粉、糊精，10倍的葡萄糖、果糖、蔗糖，同倍的维生素C不干扰5.0×10-3 g/L的大豆异黄酮测定。20种氨基酸的饱和溶液中只有半胱氨酸对测定信号有微弱干扰(信噪比小于1)，不影响实验结果；其他氨基酸无干扰。因此，采用流动注射化学发光法测定大豆异黄酮含量时，不需对样品进行纯化处理，即可准确定量。
3.4 发光机理推测
K3Fe(CN)6作为氧化剂，已用于直接化学发光法测定了维生素B1和四环素及芦丁[7]。在这些化学发光反应中，发光体为药物的氧化产物。本实验用LS45荧光光度计扫描了异黄酮标准液、K3Fe(CN)6及K3Fe(CN)6大豆异黄酮混合液的发射光谱图，结果表明，大豆异黄酮有微弱的荧光，其最大发射波长为412 nm(图`3a)。图3b是K3Fe(CN)6反射波峰，并非荧光峰，与图3c中第一个峰相同。当加入K3Fe(CN)6后，大豆异黄酮被K3Fe(CN)6氧化，大豆异黄酮的荧光减弱，加入的K3Fe(CN)6量越多，异黄酮的荧光就越弱，其氧化产物的最大发射波长为350～600 nm(图3c)。这说明该化学发光体系的发光体为异黄酮氧化的产物。氧化产物吸收了该反应所放出的化学能被激发，由激发态降到基态的这部分能量以光子的形式释放。
3.5 样品分析、回收率实验
根据单因素及正交试验结果，确定超声法提取大豆异黄酮的最佳实验条件为乙醇浓度80%、料液比1∶6、50℃超声处理1 h(超声频率40 kHz、超声功率为200 W)。取5 g 脱脂豆粉于100 mL三角瓶中超声提取，将浸提液趁热真空抽滤，测定滤液体积。吸取滤液10 mL，测定大豆异黄酮含量。另取10 mL滤液，在105℃下烘干，称量固形物的质量，计算大豆异黄酮的含量。
图3 大豆异黄酮(a)、铁氰化钾(b)及大豆异黄酮+铁氰化钾(c)的发射光谱(略)
Fig.3 Emission spectra of soybean isoflavone (a), hexacyanoferrate (b) and soybean isoflavone and hexacyanoferrate (c)
表1 回收率实验结果(略)
Table 1 Results of recovery experiments
References
1 Wu Daoyin (吴道银), Luo Honglin (罗红林). Journal of Grain Processing (粮食加工), 2004, 2: 45~46
2 Zhao Xiaofeng (赵晓峰), Wu Rongshu (吴荣书). Journal of Lipidic Engineering(油脂工程), 2004, 8: 39~41
3 Zhang Yongzhong (张永忠), Sun Yanmei (孙艳梅). Journal of Chinese Cereals and Oils Association(中国粮油学报), 2004, 19(4): 50~52
4 KritzSilversteid D， GoodmanGruen D L. Journal of Women′s Health Gend Based Med., 2002, 11(1): 69~78
5 Pan Liaoming (潘廖明), Yao Kai (姚 开), Jia Dongying (贾冬英), He Qiang (何 强), Lü Yuanping (吕远平). Journal of China Lipid (中国油脂), 2003, 28(11): 85~87
6 Hao Zaibin (郝再彬), Wu Donglan (吴东岚). Journal of Acta Agriculture Nucleatae Sinica (核农学报), 2004, 18(3): 204~206
7 Li Baoxin (李保新), Liu Wei (刘 伟), Zhang Zhujun (章竹君). Chinese J. Anal. Chem. (分析化学), 2001, 29(4): 428~430
本文系国家863基金资助项目(No.2003AA207060)
(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)
(中国农科院作物品种资源研究所，北京 100081), 百拇医药(杨丹 苍晶 郝再彬* 邱丽娟)
关键词 流动注射，化学发光，大豆异黄酮
1 引言
大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的次生代谢产物，属于黄酮类化合物，主要以异黄酮糖苷和相应的苷元形式存在[1,2]。大豆异黄酮具有弱雌激素、抗氧化、抗溶血和抗真菌等活性，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多种疾病的发生[3，4]。超声波具有强烈振动和空化效应，可以加速有效成分的溶出，从而缩短提取时间，提高产物得率[5]。在大豆异黄酮的乙醇提取液中，色素、糖和醇溶性蛋白等杂质也一起被提取出来。异黄酮与杂蛋白的紫外吸收峰较近，若用紫外分光光度法测定大豆异黄酮的含量，背景吸收较大，杂质将严重干扰异黄酮的测定。研究发现，在碱性介质中，K3Fe(CN)6可以直接氧化大豆异黄酮产生较强的化学发光，从而克服了杂质的影响。因此，提出了一种测定大豆异黄酮含量的流动注射化学发光法。该方法具有操作简便，灵敏度高，线性范围宽，成本低，且具有测定大批量的异黄酮等优点，已成功地用于大豆中异黄酮的测定。
2 实验部分
2.1 材料、试剂和仪器
测定用大豆样品(化学诱变东农42大豆品种，在其后代中筛选出来遗传稳定的第5代品系HK808[6])；大豆异黄酮标准品(为日本和光纯药工业株式会社)。其余试剂均为国产分析纯。
KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LS45荧光光度计(美国Perkin Eimer公司)；MPIB型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈电子有限公司)。
2.2 实验方法
化学发光分析仪的主蠕动泵分别将载流H2O和K3Fe(CN)6溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入分析系统。待基线平稳后，副蠕动泵将大豆异黄酮溶液以35 r/min的流速通过十六通注射阀(注样时间：10 s)注入载流中，与K3Fe(CN)6溶液混合，在流通池中产生化学发光，根据化学发光强弱采用外标法定量。
3 结果与讨论
3.1 化学发光动力学曲线
K3Fe(CN)6氧化大豆异黄酮产生化学发光(图1)，从进样到化学发光达到最大值约为4 s。6 s后发光强度衰减至本底附近。
3.2 测定大豆异黄酮条件的选择
3.2.1 氧化剂的选择 在酸性介质(1 mol/L H2SO4)中KMnO4和在碱性介质(0.5mol/L NaOH)中K3Fe(CN)6、H2O2分别做氧化剂,进行直接氧化异黄酮产生化学发光的研究表明，酸性KMnO4的氧化性强于碱性K3Fe(CN)6，酸性KMnO4不仅可以氧化异黄酮，还可以氧化多羟基醇、糖、维生素C等物质，影响实验效果;而K3Fe(CN)6在该体系中只氧化异黄酮。因此，本实验选择碱性的K3Fe(CN)6作为氧化剂。
图1 化学发光动力学曲线(略)
Fig.1 Kinetic curve of chemiluminescence
异黄酮: 0.5 g/L; NaOH: 0.5 mol/L; K3Fe(CN)6: 5.0×10-4 mol/L。
3.2.2 K3Fe(CN)6与NaOH浓度影响 K3Fe(CN)6的浓度对该体系化学发光强度有很大影响。本实验在固定了大豆异黄酮和碱性介质的浓度下，考察了不同浓度K3Fe(CN)6(0～1×10-3mol/L)和NaOH(1.0×10-5～1.0 mol/L)对该化学发光反应的影响。结果表明，当K3Fe(CN)6的浓度为5.0×10-4 mol/L时，发光强度最大(图2)。K3Fe(CN)6只有在碱性介质中，才能氧化大豆异黄酮产生化学发光。而NaOH的最佳浓度为0.5 mol/L。
3.2.3 流速的影响 在该化学发光流动体系中，流速太慢导致最大发光在流通池之前；流速太快导致发光在流通池之后。主蠕动泵和副蠕动泵转数为0～99 r/min，对它们的转数进行了组合设定发现，最佳转数分别为45和35 r/min。
图2 K3Fe(CN)6的影响(略)
Fig.2 Effect of K3Fe(CN)6 concentration on the chemiluminesecence intensity
从进样到化学发光达到最大值需要2 s，调整阀池距为2 cm时使最大发光恰好能被光电倍增管完全检测。
3.2.4 线性范围、检出限及灵敏度 在最佳条件下，测定了峰面积(A)与大豆异黄酮浓度(C)的关系，结果表明，大豆异黄酮浓度在1.0×10-3～0.5 g/L的范围内具有良好的线性关系，其回归方程为：A=193305C(mg/L)+229.97，r=0.9962。对5.0 mg/L大豆异黄酮溶液连续测定，每次得3个峰值，重复7次，相对标准差为246%。根据IUPAC的建议，本方法的检出限为4.6×10-4 g/L。
3.3 干扰实验
在提取大豆过程中共存其它组分(蛋白质、无机盐、糖类、皂甙等)，它们可能对该化学发光体系测定大豆异黄酮有一定的影响。研究结果表明：1000倍的Na+、Cl-、K+、Br-、CO2-3、SO2-4和NO-3，100倍的淀粉、糊精，10倍的葡萄糖、果糖、蔗糖，同倍的维生素C不干扰5.0×10-3 g/L的大豆异黄酮测定。20种氨基酸的饱和溶液中只有半胱氨酸对测定信号有微弱干扰(信噪比小于1)，不影响实验结果；其他氨基酸无干扰。因此，采用流动注射化学发光法测定大豆异黄酮含量时，不需对样品进行纯化处理，即可准确定量。
3.4 发光机理推测
K3Fe(CN)6作为氧化剂，已用于直接化学发光法测定了维生素B1和四环素及芦丁[7]。在这些化学发光反应中，发光体为药物的氧化产物。本实验用LS45荧光光度计扫描了异黄酮标准液、K3Fe(CN)6及K3Fe(CN)6大豆异黄酮混合液的发射光谱图，结果表明，大豆异黄酮有微弱的荧光，其最大发射波长为412 nm(图`3a)。图3b是K3Fe(CN)6反射波峰，并非荧光峰，与图3c中第一个峰相同。当加入K3Fe(CN)6后，大豆异黄酮被K3Fe(CN)6氧化，大豆异黄酮的荧光减弱，加入的K3Fe(CN)6量越多，异黄酮的荧光就越弱，其氧化产物的最大发射波长为350～600 nm(图3c)。这说明该化学发光体系的发光体为异黄酮氧化的产物。氧化产物吸收了该反应所放出的化学能被激发，由激发态降到基态的这部分能量以光子的形式释放。
3.5 样品分析、回收率实验
根据单因素及正交试验结果，确定超声法提取大豆异黄酮的最佳实验条件为乙醇浓度80%、料液比1∶6、50℃超声处理1 h(超声频率40 kHz、超声功率为200 W)。取5 g 脱脂豆粉于100 mL三角瓶中超声提取，将浸提液趁热真空抽滤，测定滤液体积。吸取滤液10 mL，测定大豆异黄酮含量。另取10 mL滤液，在105℃下烘干，称量固形物的质量，计算大豆异黄酮的含量。
图3 大豆异黄酮(a)、铁氰化钾(b)及大豆异黄酮+铁氰化钾(c)的发射光谱(略)
Fig.3 Emission spectra of soybean isoflavone (a), hexacyanoferrate (b) and soybean isoflavone and hexacyanoferrate (c)
表1 回收率实验结果(略)
Table 1 Results of recovery experiments
References
1 Wu Daoyin (吴道银), Luo Honglin (罗红林). Journal of Grain Processing (粮食加工), 2004, 2: 45~46
2 Zhao Xiaofeng (赵晓峰), Wu Rongshu (吴荣书). Journal of Lipidic Engineering(油脂工程), 2004, 8: 39~41
3 Zhang Yongzhong (张永忠), Sun Yanmei (孙艳梅). Journal of Chinese Cereals and Oils Association(中国粮油学报), 2004, 19(4): 50~52
4 KritzSilversteid D， GoodmanGruen D L. Journal of Women′s Health Gend Based Med., 2002, 11(1): 69~78
5 Pan Liaoming (潘廖明), Yao Kai (姚 开), Jia Dongying (贾冬英), He Qiang (何 强), Lü Yuanping (吕远平). Journal of China Lipid (中国油脂), 2003, 28(11): 85~87
6 Hao Zaibin (郝再彬), Wu Donglan (吴东岚). Journal of Acta Agriculture Nucleatae Sinica (核农学报), 2004, 18(3): 204~206
7 Li Baoxin (李保新), Liu Wei (刘 伟), Zhang Zhujun (章竹君). Chinese J. Anal. Chem. (分析化学), 2001, 29(4): 428~430
本文系国家863基金资助项目(No.2003AA207060)
(东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030)
(中国农科院作物品种资源研究所，北京 100081), 百拇医药(杨丹 苍晶 郝再彬* 邱丽娟)