摘要 发展高效的病毒检测技术已成为当今生物学研究的热点之一。本研究将反转录聚合酶链式反应(PCR)技术与电化学发光分析方法结合起来，用于检测兰花中齿兰环斑病毒。检测过程中采用生物素标记的探针与PCR产物杂交，可起到筛选特异性产物的作用，从而避免假阳性结果的产生。三联吡啶钌标记探针与PCR产物杂交，既可以起到进一步筛选目的片段的作用，又可与分析液中的三丙胺反应，从而产生光信号，被电化学发光仪所检测到。在引物的5′端分别连接一段特异性核酸序列，既提高了钌探针与特异性产物的杂交几率，又增强了样品检测信号，从而提高了信躁比。实验结果表明：此方法灵敏度高、稳定性好、操作简单，可以从兰花样品中准确地检测到齿兰环斑病毒，有望发展成为一种高效的病毒检测方法。

    关键词 电化学发光，齿兰环斑病毒，三联吡啶钌

     1 引言

    电化学发光(ECL)是通过一些特殊的物质在电极表面发生反应，然后这些电生的物质之间或电生物质与其他物质之间进一步反应产生的一种发光现象[1,2],其工作原理如图1所示。在一定的电压作用下，化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和电子供体三丙胺(TPA)在阳极表面分别被氧化成[Ru(bpy)3]3+ 和TPA+*。TPA+*很不稳定，失去一个质子(H+)，形成强还原剂TPA*。([Ru(bpy)3]3+和TPA*)两个反应基团在电极表面迅速反应，[Ru(bpy)3]3+被还原形成激发态的二价[Ru(bpy)3]2+*，TPA*自身被氧化成二丙胺(DPA)和丙醛(PA)。接着激发态的[Ru(bpy)3]2+*衰减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长为614 nm的光子。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强，从而使检测灵敏度大大提高[3，4]。

    图1 电化学发光原理图(略)

    Fig.1 Mechanism of electrochemiluminescnece (ECL) excitation

    齿兰环斑病毒(ORSV)属烟草花叶病毒属(tobamovirus), 是分布很广的单链RNA 病毒，也是目前危害兰科植物的主要病毒之一。感染此病毒的植株的叶片上形成退绿条纹、坏死的圈斑甚至出现畸形，严重影响了兰花的观赏价值和收藏价值[5,6]。它主要危害齿兰、建兰、墨兰等。目前, 检测病毒主要有血清学检测法、电镜检测法和分子生物学法即聚合酶链式反应(PCR)电泳技术。但以上这些方法都有明显的不足之处, 如血清学法制备抗体复杂、费时费力，且灵敏度不高；电镜技术制备样品较为复杂；分子生物学方法扩增特异性序列后 ......