中华医学会第九次全国心血管病学术会议(五)通络方剂抑制炎症、保护内皮、稳定斑块、抗心律失常机制研究进
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(续8月24日第20版)
标本采集
造影结束后,我们用致死剂量苯巴比妥(1500~2000 mg)处死动物,放血,摘除心脏;截取包裹纸巾的冠脉节段,分为三段,分别置于4%多聚甲醛中固定(用于光镜检测)和液氮中迅速冷冻,-70℃ 保存(用于分子生物学检测)。
病理检查
光镜观察血管形态学变化 我们将冠脉节段经HE染色,在光镜下观察血管形态学变化,并采用计算机图像分析系统计算管腔面积、内弹力板及外弹力板包裹面积。
RT-PCR测定Rho激酶 mRNA表达 我们采用异硫氰酸胍法提取血管标本中总RNA,并取其1 μl,采用RNA PCR Kit逆转录试剂盒(上海生工)合成cDNA;取2 μl逆转录产物进行PCR扩增反应,以β-肌动蛋白为内参照。Rho激酶引物序列:上游引物为5-GAG CAA CTA TGA TGT GCC TGA AAA AT-3,下游引物为5-GAT GTC GTT TGA TTT CTT CTA C-3,产物为512 bp。β-肌动蛋白引物序列:上游引物为5-GGG ACC TGA CCG ACT ACC TC-3,下游引物为5-GGG CGA TGA TCT TGA TCT TC-3,产物为245 bp[引物均由宝生物(大连)有限公司合成]。扩增条件为90℃变性10分钟后进行以下循环:94℃ 80秒,55℃ 90秒,72℃ 60秒,共循环40次,最后72℃延伸10分钟。我们取5 μl扩增产物,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色,然后经凝胶图像扫描系统扫描,以β-肌动蛋白为内参照进行光密度分析,测定样本mRNA的相对表达量。
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蛋白印迹法测肌球蛋白结合亚基磷酸化(MBS-P)水平表达 我们将血管标本剪碎后加入蛋白裂解液,经匀浆机匀浆后,采用考马斯亮蓝法测定目的蛋白浓度;经聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭非特异性抗原;加入1:100的一抗(山羊抗人MBS-P单克隆抗体,日本九州大学赠送),4℃过夜,再加入1:1000二抗(驴抗山羊IgG),37℃ 2小时,经显色液显色15分钟,采用流水终止反应;用荧光扫描仪扫描计算MBS的相对量。
统计学处理
我们使用SPSS11.5软件进行分析处理,所有数据采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较计数资料采用t检验,计量资料采用?掊 2检验,P <0.05为差异有统计学意义。
结 果
冠状动脉痉挛模型构建成功
我们对动物行开胸手术后2周,进行第一次冠状动脉造影显示,12只小型猪冠状动脉包裹IL-1β局部血管段发生不同程度的管腔狭窄(10%~30%),5-羟色胺能诱发其痉挛。在建模过程中,16只小猪中因麻醉意外死亡1只,开胸剥离血管破裂死亡2只,造影诱发痉挛死亡1只。
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各组诱发冠状动脉痉挛情况
实验结束后12只小型猪全部存活,并接受第二次冠状动脉造影及5-羟色胺诱发痉挛。实验结果显示:对照组有11条(91%)血管段5-羟色胺诱发痉挛阳性,1条(9%)血管段5-羟色胺诱发痉挛阴性;通心络组有2条(17%)血管段5-羟色胺诱发痉挛阳性,10条(83%)血管段5-羟色胺诱发痉挛阴性(见表1,图1、2,图1见8月24日第20版)。
(未完待续)
图2 通心络组干预前后两次诱发冠脉痉挛造影图
注:图2a 为通心络组干预前诱发冠脉痉挛前造影,前降支、回旋支轻度狭窄;图2b 为通心络组干预前诱发冠脉痉挛后造影,5-羟色胺诱发冠脉痉挛阳性;图2c 为通心络组干预后(1个月后)诱发冠脉痉挛前造影,前降支、回旋支轻度狭窄(较干预前狭窄程度减轻);图2d 为通心络组干预后(1个月后)诱发痉挛后造影,5-羟色胺诱发冠脉痉挛阴性。
图3 光镜下各组手术处理血管段病理学改变(相关内容见9月7日第24版)
注:图3a、3b 为对照组,病理检查示内膜明显增生,炎症细胞浸润,平滑肌内膜下迁移;图3c、3d 为通心络组,病理检查示轻度内膜增生,增生程度较对照组明显减轻。, http://www.100md.com