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CD40发夹siRNA真核表达质粒与siRNA表达框架对CA46细胞CD40表达的影响

http://www.100md.com 《福建医科大学学报》 2006年第4期

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     摘要:目的构建人类CD40膜蛋白siRNA真核表达质粒，观察其能否抑制CA46细胞CD40表达。方法合成2条编码发夹siRNA序列的单链DNA，克隆到pSilenCircle载体中，构建成含目的基因片段的重组质粒——siCD40/pSilenCircle，在pol Ⅲ U6基因启动子控制下表达siRNA。同样方法构建相对应的编码反义RNA以及无关基因的重组质粒antiCD40/pSilenCircle和siFly/pSilenCircle，以作比较和对照。PCR制备CD40SECs(CD40siRNA表达框架)。以脂质体FuGene 6为介质瞬时转染CA46细胞，利用流式细胞技术检测细胞膜CD40的表达。结果(1)成功构建了CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40/pSilenCircle、CD40反义RNA真核表达质粒antiCD40/pSilenCircle和无关基因重组质粒siFly/pSilenCircle；(2)PCR成功制备CD40SEC；(3)与siFly/pSilenCircle转染组相比较，siCD40/pSilenCircle、antiCD40/pSilenCircle和CD40SEC转染组的CA46细胞CD40的表达均明显减少。结论CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40/pSilenCircle和CD40SEC可有效地抑制CA46细胞CD40分子的表达。RNA干扰技术可望作为一种有效的调控基因功能的工具。

    关键词:RNA,interference； RNA,small interfering；抗原，CD40；质粒； CA46细胞

    RNA干扰(RNAi)现象是抵御外来病毒感染或转基因的一种重要保护机制，能介导序列特异性的RNA降解，从而在细胞内发挥类似基因敲除的作用。CD40/CD40L途径是B7/CD28途径之外的又一重要的共刺激途径，在免疫反应、炎症及肿瘤的发生发展中发挥重要作用。CD40信号可促进B细胞增殖、分化，在IL4、IL10等Th2类因子的协同下还可促进抗体同种型转换。CD40与CD40L的过度表达或功能的异常可能引起免疫细胞的异常活化，导致免疫性疾病的发生。因此，笔者构建CD40 siRNA真核表达重组质粒以及PCR制备CD40 siRNA表达框架(SEC)，分别转染CA46细胞，观察它们对CA46细胞上CD40表达的影响。

     1材料和方法

    1.1材料CA46细胞株ATCC编号为CRL1648，由福建省血液病研究所惠赠，细胞表面表达CD40分子 ......

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