冈田酸诱导SHSY5Y细胞tau蛋白的过度磷酸化
摘要:目的观察冈田酸(OA)对SHSY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响。方法MTT比色法观察OA对SHSY5Y细胞代谢率的影响,免疫细胞化学法和蛋白免疫印迹法观察OA对SHSY5Y细胞磷酸化tau蛋白水平的影响。结果40 nmol/L OA孵育SHSY5Y细胞24 h可显著降低细胞代谢率,其效应随着OA浓度的增加和孵育时间的延长而增强。OA作用于细胞3~48 h,蛋白免疫印迹显示Ser396位点磷酸化tau蛋白水平逐步升高,24 h达高峰,之后下降。免疫细胞化学法显示,OA作用于细胞24 h,Ser396位点磷酸化tau蛋白水平较对照组细胞增强。结论OA增强SHSY5Y细胞tau蛋白Ser396位点磷酸化水平。
关键词:冈田酸; tau蛋白质类; 磷酸化; 阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)是一种慢性、进行性神经变性疾病,临床上主要表现为进行性的记忆下降、认知障碍和行为异常。AD的病因和发病机制未完全阐明,目前普遍认为tau蛋白的过度磷酸化在促进AD患者神经细胞退行性变性中起着关键作用\[12\]。冈田酸(OA)是一种蛋白磷酸酶抑制剂。有报道,OA作用于神经母细胞与胶质细胞的杂交瘤细胞(NG10815细胞),可引起细胞内tau蛋白发生过度磷酸化\[3\]。人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y细胞)具有神经元的形态特点,且tau蛋白含量较高,调节tau蛋白磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的含量也较高\[4\]。笔者采用蛋白免疫印迹法和免疫细胞化学法,观察OA对SHSY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)。
1.1.2试剂OA(美国Sigma公司);DMEM/F12培养液(美国Gibco公司);四甲基偶氮唑盐(美国Sigma公司);βactin单克隆抗体(美国Sigma公司);tau\[pS396\]多克隆抗体(美国Santa Cruze公司);免疫组织化学SP超敏试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。
1.1.3仪器CO2培养箱(美国Forma Scientific公司);倒置显微镜(CK40型,日本Olympus公司);低温离心机(Microfuge 22R,美国Beckman公司);垂直型蛋白电泳槽、转膜装置(北京六一仪器厂);电泳仪(PowerPac3000型,美国BioRad公司);酶标仪(Model550型,美国BioRad公司)。
1.2方法
1.2.1细胞培养SHSY5Y细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养,隔3~4 d传代。MTT实验以每孔1×104细胞接种于96孔板;免疫细胞化学实验以每孔4×104细胞接种于24孔板;免疫印迹实验以每孔3×105细胞接种于6孔板。
1.2.2实验分组(1)OA组:OA(40 nmol/L)孵育细胞24 h;(2)对照组:加等体积的培养液,未加任何干预的正常细胞。
1.2.3MTT测定法\[5\]细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液配成单细胞悬液,每孔100 μL接种于96孔培养板,移入培养箱,待细胞完全贴壁后,每孔加入用培养液配成的OA,终浓度分别为10,20,40,80,160 nmol/L,对照组加等体积的培养液。每种浓度4个复孔,培养24,48,72 h后,每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL,继续孵育4 h,弃上清,每孔加DMSO 150 μL,震荡10 min,使结晶物充分溶解,酶标仪测定光密度\[D(570 nm)\]。
1.2.4免疫细胞化学法\[6\]将培养于盖玻片上的细胞用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗3次,每次3~5 min;3%H2O2室温孵育15 min,PBS洗3次,每次3~5 min;封闭血清(正常非免疫动物血清)室温孵育30 min,PBS洗3次,每次3~5 min;兔抗人磷酸化tau蛋白多克隆抗体pSer396(用含0.1%TrionX100的PBS稀释为1∶200)4 ℃孵育过夜,PBS洗3次,每次3~5 min;生物素标记的第二抗体室温孵育15 min,PBS洗3次,每次3~5 min;链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液室温孵育15 min,PBS洗3次,每次3~5 min;用新鲜配制的DAB溶液显色3~5 min;自来水冲洗,60 ℃烘干后中性树胶封固。实验重复3次。
SHSY5Y细胞tau蛋白的过度磷酸化1.2.5蛋白免疫印迹法\[7\]40 nmol/L OA处理细胞0,3,6,12,24,48 h后,将培养液吸弃,用预冷的PBS清洗2次,每孔加入细胞裂解液50 μL,在冰面上裂解20 min,4 ℃离心10 min(11 000 r/min),吸取上清。Bradford法进行蛋白定量。10%SDSPAGE电泳(浓缩胶:恒压80 V,电泳约45 min;分离胶:恒压120 V,电泳约1.5 h);用湿式转移法转至NC膜,用含5%脱脂奶粉的TBST 4 ℃封闭过夜。加入用封闭液稀释的tau\[pS396\]多克隆抗体(1∶1 000稀释),37 ℃孵育2 h。TBST漂洗后,加入碱性磷酸酶标记的抗兔IgG抗体(1∶500稀释)室温孵育1 h,BCIP/NBT显色。以βactin为内参照,实验重复3次。
1.2.6统计学处理测定值以x±s表示,采用SPSS 10.0软件包分析。
2结果
2.1OA对SHSY5Y细胞代谢率的影响SHSY5Y细胞经OA处理24,48,72 h后,测定D值,以正常对照组(扣除空白对照组)细胞代谢率为100%,其余各组D值与之相比得到各自的细胞代谢率(表1)。表1冈田酸对SHSY5Y细胞代谢率的影响%
2.2OA对SHSY5Y细胞磷酸化tau蛋白水平的影响40 nmol/L的OA作用于SHSY5Y细胞0,3,6,12,24,48 h后,蛋白免疫印迹检测Ser396位点磷酸化tau蛋白水平,使用条带密度分析法进行半定量分析,以0 h组蛋白量为1,其他各组条带密度值与之相比得到各自的蛋白相对量(图1)。磷酸化tau蛋白水平在3 h开始增加,24 h达到最高峰,之后下降,但仍然高于正常水平,提示OA可提高SHSY5Y细胞磷酸化tau蛋白水平。
40 nmol/L OA作用于SHSY5Y细胞24 h,免疫细胞化学法检测细胞Ser396位点磷酸化tau蛋白(图2)。对照组细胞内可见Ser396磷酸化tau蛋白样免疫阳性反应特异性染色,免疫阳性反应物分布于细胞质及部分突起;而OA组细胞内该蛋白样免疫阳性反应强度明显强于对照组,提示OA可增强Ser396位点磷酸化tau蛋白水平。
A:对照组,细胞质及部分突起内有免疫阳性反应特异性染色物沉积; B:冈田酸组,细胞质及部分突起内有免疫阳性反应特异性染色物沉积,强度高于对照组.
图2SHSY5Y细胞中tau\[pSer396\] 蛋白变化(SP染色 ×400)
Fig 2The change of phosphorylated tau protein at site of Ser396 in SHSY5Y cells
3讨论
AD患者脑内标志性病理变化是老年斑(SP)和神经原纤维缠结(NFT)。NFT主要由双股螺旋丝(PHF)所组成,其主要成分是过度磷酸化的tau蛋白。tau蛋白属于微管相关蛋白,主要存在于神经元的轴突和细胞质,主要功能是促进微管蛋白聚集形成微管,并增强其稳定性、维持细胞的生长发育\[8\]。目前发现,tau蛋白至少存在30个Ser或Thr磷酸化位点,这些磷酸化位点主要集中在微管结合区,其中有一些重要的磷酸化位点,如Ser396、Ser202、Thr231位点,参与调节tau蛋白与微管的结合活性\[9\]。在AD病理条件下,这些位点发生异常过度磷酸化,从而失去了与微管结合的能力,聚集并形成NFT,结果使微管解聚,细胞骨架破坏,正常轴突转运系统受损,突触丢失及逆行性退行性改变\[10\]。笔者选择Ser396位点研究tau蛋白的磷酸化改变。
OA是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂,能抑制磷酸酯酶的活性,使蛋白高度磷酸化,并可以引起氧化损伤\[1112\]。笔者先期研究表明,海马背侧微量注射 OA可显著损害大鼠空间学习记忆能力,诱发大鼠海马组织神经原纤维聚集、融合及NFT、SP的形成\[13\]。有文献介绍,OA可使NG10815细胞tau 蛋白发生过度磷酸化\[3\],因此笔者选用OA孵育SHSY5Y细胞,观察其对tau蛋白磷酸化的影响。
为研究tau蛋白磷酸化,需选用OA合适的作用浓度和作用时间,笔者采用MTT法分析OA作用后细胞代谢率的变化,发现OA浓度>40 nmol/L时,SHSY5Y细胞的代谢率明显下降,且此作用随着OA孵育时间的延长和作用浓度的增加而增强;而低于此浓度的OA对细胞的代谢率影响不大。因此,本研究采用40 nmol/L OA作用于SHSY5Y细胞,观察其对tau蛋白磷酸化水平的影响。免疫细胞化学和蛋白免疫印迹检测均显示,OA可增强Ser396位点磷酸化tau蛋白水平。由此可见,OA可诱导SHSY5Y细胞中tau蛋白发生过度磷酸化。
笔者用OA诱导SHSY5Y细胞内tau发生过度磷酸化,可用于AD的tau蛋白磷酸化机制研究及防治AD药物的研究。本研究仅观察了OA对细胞内tau蛋白Ser396位点磷酸化水平的影响,对于其他磷酸化位点的影响有待进一步研究。
参考文献:
\[1\]王建枝. tau蛋白在阿尔茨海默病神经细胞退行性变性中的作用\[J\]. 生命的化学, 2004,24(5):426428.
\[2\]周宁,杜冠华. Tau蛋白在Alzheimer's病中的作用研究进展\[J\]. 中国药理学通报, 2004,20(10):10851089.
\[3\]朱粹青,曹小定. 蛋白磷酸酯酶1和2A抑制剂对NG10815细胞tau蛋白磷酸化的影响\[J\].细胞生物学杂志, 2002,24 (2):115117.
\[4\]Haque N,Gong CX,Sengupta A,et al. Regulation of microtubuleassociated proteins,protein kinases and protein phosphatases during differentiation of SY5Y cells\[J\]. Brain Res Mol Brain Res, 2004,129(12):163170.
\[5\]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays\[J\]. Immunol Methods, 1983,65(12):5563.
\[6\]张素娟,余英豪. 介绍一种新的免疫组化染色方法SP法\[J\]. 第一军医大学学报, 1994,14(1):19.
\[7\]汪家政,范明. 蛋白质技术手册\[M\].北京:科学出版社, 2000:7790.
\[8\]吴琪. Alzheimer病神经原纤维缠结与tau蛋白研究\[J\]. 中国神经精神病杂志, 2000;26(1):6364.
\[9\]王建枝,魏泽兰,王群,等. 蛋白磷酸化位点与其促微管组装及与微管结合活性的体外分析\[J\]. 中国医学科学院学报, 2000,(2):120123.
\[10\]Iqbal K,Alonso AC,ElAkkad E,et al. Significance and mechanism of Alzheimer neurofibrillary degeneration and therapeutic targets to inhibit this lesion\[J\]. Mol Neurosci, 2002,19(12):9599.
\[11\]Fernandez JJ,Candenas ML,Souto ML,et al. Okadaic acid,useful tool for studying cellular processes\[J\]. Curr Med Chem, 2002,9(2):229262.
\[12\]MontillaLopez P,MunozAgueda MC,Feijoo LM,et al. Comparison of melatonin versus vitamin C on oxidative stress and antioxidant enzyme activity in Alzheimer's disease induced by okadaic acid in neuroblastoma cells\[J\]. Pharmacol, 2002,451(3):237243.
\[13\]张章,俞昌喜,高凌云,等. 一种简易的实验性阿尔茨海默病大鼠模型\[J\]. 福建医科大学学报, 2002,36(4):459461.
基金项目: 福建省自然科学基金资助项目(C0410018,C0010013)
作者单位: 福建医科大学 药学院药理学系, 福州350004, 百拇医药(许文芳, 吴敏霞, 谢捷明, 韩静, 许盈, 俞昌)
关键词:冈田酸; tau蛋白质类; 磷酸化; 阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)是一种慢性、进行性神经变性疾病,临床上主要表现为进行性的记忆下降、认知障碍和行为异常。AD的病因和发病机制未完全阐明,目前普遍认为tau蛋白的过度磷酸化在促进AD患者神经细胞退行性变性中起着关键作用\[12\]。冈田酸(OA)是一种蛋白磷酸酶抑制剂。有报道,OA作用于神经母细胞与胶质细胞的杂交瘤细胞(NG10815细胞),可引起细胞内tau蛋白发生过度磷酸化\[3\]。人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y细胞)具有神经元的形态特点,且tau蛋白含量较高,调节tau蛋白磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的含量也较高\[4\]。笔者采用蛋白免疫印迹法和免疫细胞化学法,观察OA对SHSY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)。
1.1.2试剂OA(美国Sigma公司);DMEM/F12培养液(美国Gibco公司);四甲基偶氮唑盐(美国Sigma公司);βactin单克隆抗体(美国Sigma公司);tau\[pS396\]多克隆抗体(美国Santa Cruze公司);免疫组织化学SP超敏试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。
1.1.3仪器CO2培养箱(美国Forma Scientific公司);倒置显微镜(CK40型,日本Olympus公司);低温离心机(Microfuge 22R,美国Beckman公司);垂直型蛋白电泳槽、转膜装置(北京六一仪器厂);电泳仪(PowerPac3000型,美国BioRad公司);酶标仪(Model550型,美国BioRad公司)。
1.2方法
1.2.1细胞培养SHSY5Y细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养,隔3~4 d传代。MTT实验以每孔1×104细胞接种于96孔板;免疫细胞化学实验以每孔4×104细胞接种于24孔板;免疫印迹实验以每孔3×105细胞接种于6孔板。
1.2.2实验分组(1)OA组:OA(40 nmol/L)孵育细胞24 h;(2)对照组:加等体积的培养液,未加任何干预的正常细胞。
1.2.3MTT测定法\[5\]细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液配成单细胞悬液,每孔100 μL接种于96孔培养板,移入培养箱,待细胞完全贴壁后,每孔加入用培养液配成的OA,终浓度分别为10,20,40,80,160 nmol/L,对照组加等体积的培养液。每种浓度4个复孔,培养24,48,72 h后,每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL,继续孵育4 h,弃上清,每孔加DMSO 150 μL,震荡10 min,使结晶物充分溶解,酶标仪测定光密度\[D(570 nm)\]。
1.2.4免疫细胞化学法\[6\]将培养于盖玻片上的细胞用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗3次,每次3~5 min;3%H2O2室温孵育15 min,PBS洗3次,每次3~5 min;封闭血清(正常非免疫动物血清)室温孵育30 min,PBS洗3次,每次3~5 min;兔抗人磷酸化tau蛋白多克隆抗体pSer396(用含0.1%TrionX100的PBS稀释为1∶200)4 ℃孵育过夜,PBS洗3次,每次3~5 min;生物素标记的第二抗体室温孵育15 min,PBS洗3次,每次3~5 min;链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液室温孵育15 min,PBS洗3次,每次3~5 min;用新鲜配制的DAB溶液显色3~5 min;自来水冲洗,60 ℃烘干后中性树胶封固。实验重复3次。
SHSY5Y细胞tau蛋白的过度磷酸化1.2.5蛋白免疫印迹法\[7\]40 nmol/L OA处理细胞0,3,6,12,24,48 h后,将培养液吸弃,用预冷的PBS清洗2次,每孔加入细胞裂解液50 μL,在冰面上裂解20 min,4 ℃离心10 min(11 000 r/min),吸取上清。Bradford法进行蛋白定量。10%SDSPAGE电泳(浓缩胶:恒压80 V,电泳约45 min;分离胶:恒压120 V,电泳约1.5 h);用湿式转移法转至NC膜,用含5%脱脂奶粉的TBST 4 ℃封闭过夜。加入用封闭液稀释的tau\[pS396\]多克隆抗体(1∶1 000稀释),37 ℃孵育2 h。TBST漂洗后,加入碱性磷酸酶标记的抗兔IgG抗体(1∶500稀释)室温孵育1 h,BCIP/NBT显色。以βactin为内参照,实验重复3次。
1.2.6统计学处理测定值以x±s表示,采用SPSS 10.0软件包分析。
2结果
2.1OA对SHSY5Y细胞代谢率的影响SHSY5Y细胞经OA处理24,48,72 h后,测定D值,以正常对照组(扣除空白对照组)细胞代谢率为100%,其余各组D值与之相比得到各自的细胞代谢率(表1)。表1冈田酸对SHSY5Y细胞代谢率的影响%
2.2OA对SHSY5Y细胞磷酸化tau蛋白水平的影响40 nmol/L的OA作用于SHSY5Y细胞0,3,6,12,24,48 h后,蛋白免疫印迹检测Ser396位点磷酸化tau蛋白水平,使用条带密度分析法进行半定量分析,以0 h组蛋白量为1,其他各组条带密度值与之相比得到各自的蛋白相对量(图1)。磷酸化tau蛋白水平在3 h开始增加,24 h达到最高峰,之后下降,但仍然高于正常水平,提示OA可提高SHSY5Y细胞磷酸化tau蛋白水平。
40 nmol/L OA作用于SHSY5Y细胞24 h,免疫细胞化学法检测细胞Ser396位点磷酸化tau蛋白(图2)。对照组细胞内可见Ser396磷酸化tau蛋白样免疫阳性反应特异性染色,免疫阳性反应物分布于细胞质及部分突起;而OA组细胞内该蛋白样免疫阳性反应强度明显强于对照组,提示OA可增强Ser396位点磷酸化tau蛋白水平。
A:对照组,细胞质及部分突起内有免疫阳性反应特异性染色物沉积; B:冈田酸组,细胞质及部分突起内有免疫阳性反应特异性染色物沉积,强度高于对照组.
图2SHSY5Y细胞中tau\[pSer396\] 蛋白变化(SP染色 ×400)
Fig 2The change of phosphorylated tau protein at site of Ser396 in SHSY5Y cells
3讨论
AD患者脑内标志性病理变化是老年斑(SP)和神经原纤维缠结(NFT)。NFT主要由双股螺旋丝(PHF)所组成,其主要成分是过度磷酸化的tau蛋白。tau蛋白属于微管相关蛋白,主要存在于神经元的轴突和细胞质,主要功能是促进微管蛋白聚集形成微管,并增强其稳定性、维持细胞的生长发育\[8\]。目前发现,tau蛋白至少存在30个Ser或Thr磷酸化位点,这些磷酸化位点主要集中在微管结合区,其中有一些重要的磷酸化位点,如Ser396、Ser202、Thr231位点,参与调节tau蛋白与微管的结合活性\[9\]。在AD病理条件下,这些位点发生异常过度磷酸化,从而失去了与微管结合的能力,聚集并形成NFT,结果使微管解聚,细胞骨架破坏,正常轴突转运系统受损,突触丢失及逆行性退行性改变\[10\]。笔者选择Ser396位点研究tau蛋白的磷酸化改变。
OA是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂,能抑制磷酸酯酶的活性,使蛋白高度磷酸化,并可以引起氧化损伤\[1112\]。笔者先期研究表明,海马背侧微量注射 OA可显著损害大鼠空间学习记忆能力,诱发大鼠海马组织神经原纤维聚集、融合及NFT、SP的形成\[13\]。有文献介绍,OA可使NG10815细胞tau 蛋白发生过度磷酸化\[3\],因此笔者选用OA孵育SHSY5Y细胞,观察其对tau蛋白磷酸化的影响。
为研究tau蛋白磷酸化,需选用OA合适的作用浓度和作用时间,笔者采用MTT法分析OA作用后细胞代谢率的变化,发现OA浓度>40 nmol/L时,SHSY5Y细胞的代谢率明显下降,且此作用随着OA孵育时间的延长和作用浓度的增加而增强;而低于此浓度的OA对细胞的代谢率影响不大。因此,本研究采用40 nmol/L OA作用于SHSY5Y细胞,观察其对tau蛋白磷酸化水平的影响。免疫细胞化学和蛋白免疫印迹检测均显示,OA可增强Ser396位点磷酸化tau蛋白水平。由此可见,OA可诱导SHSY5Y细胞中tau蛋白发生过度磷酸化。
笔者用OA诱导SHSY5Y细胞内tau发生过度磷酸化,可用于AD的tau蛋白磷酸化机制研究及防治AD药物的研究。本研究仅观察了OA对细胞内tau蛋白Ser396位点磷酸化水平的影响,对于其他磷酸化位点的影响有待进一步研究。
参考文献:
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\[4\]Haque N,Gong CX,Sengupta A,et al. Regulation of microtubuleassociated proteins,protein kinases and protein phosphatases during differentiation of SY5Y cells\[J\]. Brain Res Mol Brain Res, 2004,129(12):163170.
\[5\]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays\[J\]. Immunol Methods, 1983,65(12):5563.
\[6\]张素娟,余英豪. 介绍一种新的免疫组化染色方法SP法\[J\]. 第一军医大学学报, 1994,14(1):19.
\[7\]汪家政,范明. 蛋白质技术手册\[M\].北京:科学出版社, 2000:7790.
\[8\]吴琪. Alzheimer病神经原纤维缠结与tau蛋白研究\[J\]. 中国神经精神病杂志, 2000;26(1):6364.
\[9\]王建枝,魏泽兰,王群,等. 蛋白磷酸化位点与其促微管组装及与微管结合活性的体外分析\[J\]. 中国医学科学院学报, 2000,(2):120123.
\[10\]Iqbal K,Alonso AC,ElAkkad E,et al. Significance and mechanism of Alzheimer neurofibrillary degeneration and therapeutic targets to inhibit this lesion\[J\]. Mol Neurosci, 2002,19(12):9599.
\[11\]Fernandez JJ,Candenas ML,Souto ML,et al. Okadaic acid,useful tool for studying cellular processes\[J\]. Curr Med Chem, 2002,9(2):229262.
\[12\]MontillaLopez P,MunozAgueda MC,Feijoo LM,et al. Comparison of melatonin versus vitamin C on oxidative stress and antioxidant enzyme activity in Alzheimer's disease induced by okadaic acid in neuroblastoma cells\[J\]. Pharmacol, 2002,451(3):237243.
\[13\]张章,俞昌喜,高凌云,等. 一种简易的实验性阿尔茨海默病大鼠模型\[J\]. 福建医科大学学报, 2002,36(4):459461.
基金项目: 福建省自然科学基金资助项目(C0410018,C0010013)
作者单位: 福建医科大学 药学院药理学系, 福州350004, 百拇医药(许文芳, 吴敏霞, 谢捷明, 韩静, 许盈, 俞昌)