膜融合蛋白；GSTTATGFP；基因表达_

GSTTATGFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定

http://www.100md.com 《福建医科大学学报》 2006年第4期

膜融合蛋白；GSTTATGFP；基因表达,,膜融合蛋白；GSTTATGFP；基因表达,1材料与方法,2结果,3讨论,参考文献：

     摘要:目的获得融合TAT短肽的融合蛋白GSTTATGFP，以用于阐明TAT短肽的跨膜递送机理。方法以质粒pGEXGFP为模板，扩增目的基因TATGFP，将其克隆至质粒pGEX2T，用所构建的质粒pGEXTATGFP转化大肠杆菌BL21并诱导表达，利用GS4B亲和柱进行纯化，所得产物进行SDSPAGE、Western blot及细胞跨膜实验鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约54.3 kD的蛋白，其相对分子质量与GSTTATGFP融合蛋白相符；Western blot显示该融合蛋白能够被抗GFP的抗体特异性识别；细胞实验表明融合TAT短肽的融合蛋白能跨膜进入细胞L02、SMMC7721、Hela和BEL7402。结论在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GSTTATGFP融合蛋白。

    关键词:膜融合蛋白；GSTTATGFP；基因表达

    细胞膜在细胞结构和功能方面起着至关重要的作用。由于细胞膜主要由疏水性的成分组成，因此细胞膜会阻止细胞内水溶性的物质从细胞内向细胞外渗透，同时也使很多具有治疗作用的蛋白质、多肽和寡聚核苷酸难以进入细胞，导致这些物质在治疗方面的价值受到极大限制；虽然基因疗法可望通过转录、翻译补足这些物质，但这种可使目标基因高效定位和目标蛋白长期表达的条件还有待进一步研究。因此把生物活性物质从细胞外直接导入细胞内，从而改善细胞生理状态的疗法是一个很有意义的替代方法。

    11个氨基酸(YGRKKRRQRRR)组成的反式激活转录因子(TAT)短肽是倍受瞩目的跨膜递送载体之一\[18\]。它不但自身可以跨膜进入细胞，而且能介导超过50种的蛋白和其它外源药物跨膜递送进入细胞\[46\]。Schwarze等甚至报道了融合TAT的116 kD的β半乳糖苷酶具有穿越细胞膜和血脑屏障的功能\[7\]。因此，构建并应用模型蛋白，探讨TAT短肽跨膜递送机理，对充分发挥TAT短肽在临床治疗中的作用具有重要意义。

    绿色荧光蛋白(GFP)是良好的报告蛋白和荧光标记分子，它能与多种不同蛋白质的N端或C端融合而仍然保留独立GFP的发荧光能力，而且在酸、碱、加热等条件下稳定\[9\]。GFP的这些特性，使它成为构筑模型蛋白的首选。通过TAT短肽与GFP融合而成的融合蛋白，可对TAT短肽在细胞中的递送进行定位观察和准确的定量分析。笔者在大肠杆菌BL21表达系统中表达了N端融合TAT短肽的GFP融合蛋白，应用GS4B(GlutathioneSepharose 4B)亲和色谱分离、纯化，并对该蛋白的活性进行鉴定 ......

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